Au sein du génome humain, on retrouve de manière non aléatoire des séquences riches
en cytosines et celles-ci peuvent potentiellement former des structures i-motifs107,108.
Différentes études ont également montrées que ces structures étaient impliquées dans différents
processus biologiques130,131,148 et qu’elles étaient présentes in vivo140,141. En 2012 au sein de
notre laboratoire, un premier modèle i-motif tétramoléculaire a été synthétisé à l’aide du
concept TASQ170. Ce dernier possède quatre séquences d’ADN 5’TCCCCT3’ immobilisées de
manière antiparallèle sur une plateforme peptidique (Figure 32). La conception de ce type d’édifice a permis dans un premier temps de confirmer la possibilité d’utiliser la stratégie TASQ et ainsi obtenir une structure i-motif stable sur le cyclodécapeptide. De plus, il a été observé que l’organisation sous forme i-motif était conservée sur une gamme de pH plus étendue que celle d’une séquence naturelle.
47
Figure 32 : représentation du modèle i-motif tétramoléculaire utilisant le concept TASQ170
Dans le but d’obtenir une cible plus pertinente d’un point de vue biologique (i.e.
contenant les boucles), la conception d’un édifice biomoléculaire présentant la séquence i-motif
télomérique a été élaborée lors de la thèse du Dr. L. Bonnat au sein du laboratoire171. La
stratégie de synthèse (Schéma 2) reposait sur l’utilisation de deux boucles d’ADN présentant leurs extrémités 3’ et 5’ modifiées afin de les lier indépendamment au support peptidique. Pour cela, trois ligations orthogonales ont été utilisées : la ligation oxime, le couplage thiol-chloroacétamide et la cycloaddition CuAAC.
La première étape a consisté à lier le premier oligonucléotide à l’aide de la ligation oxime et dans un second temps de réaliser la cycloaddition CuAAC afin de fermer la première boucle. Suite à cela, deux voies sont possibles. La première est de greffer le second oligonucléotide grâce au couplage thiol-chloroacétamide suivie d’une réaction de diazo-transfer sur le châssis peptidique (voie a) ou effectuer l’ordre inverse de ces deux réactions (voie b).
Dans les deux cas, on retrouve in fine l’édifice où la deuxième boucle peut être fermée par une
seconde cycloaddition CuAAC. Les raisons de finir par cette réaction sont multiples. En effet, la cycloaddition CuAAC a déjà été utilisée de nombreuses fois dans la fermeture de boucle intramoléculaire mais également cette dernière s’est montrée plus réactive que le couplage thiol-chloroacétamide. Cependant, ce mime i-motif n’a pu être obtenu au final. En effet, la dernière étape, c’est-à-dire la seconde cycloaddition CuAAC permettant de fermer la deuxième boucle, n’a pas permis d’obtenir le produit final. Différentes options ont pourtant été investiguées : réalisation de la cycloaddition dans les conditions réactionnelles usuelles
48 sodium), utilisation des conditions classiques de CuAAC mais avec la présence de 500mM de KCl dans le but de réaliser un écrantage de charge afin de limiter la répulsion électrostatique entre les deux brins d’ADN qui pourrait éventuellement éloigner les fonctions alcyne et azoture et enfin explorer l’effet du pH sur la réaction de cycloaddition afin de voir si une pré-organisation de l’édifice permettait la réussite ou non de la réaction. Pour cela un tampon
100mM de PBS a été utilisé à pH 4, 5, 6 ou 7 en présence 6 eq de CuSO4, 30 eq de THPTA et
30 eq d’ascorbate de sodium.
Schéma 2 : représentation de la précédente stratégie de synthèse pour l’assemblage du mime i-motif.
49 Malheureusement, aucune des conditions citées ci-dessus n’a permis d’obtenir l’édifice final. De plus, l’une des difficultés rencontrées au cours de cette dernière réaction est le fait qu’il n’y a aucun changement de masse mais également de charge entre l’intermédiaire et le produit final. Ceci a pour conséquence de rendre la spectrométrie de masse et la chromatographie échangeuse d’ions inutiles afin de confirmer ou infirmer la présence de l’édifice final. Ainsi concernant cette dernière étape, il fallait espérer un changement de temps de rétention lors du suivi par HPLC ce qui n’a pas été le cas.
Suite à cela et dans le cadre cette thèse, une nouvelle stratégie a été élaborée afin d’obtenir un mime i-motif. Comme précédemment, celle-ci repose sur l’utilisation de deux brins d’ADN modifiés aux extrémités 3’ et 5’. Dans le plan de synthèse de cet édifice (Schéma 3), les trois ligations chimiques mais également la modification sur le châssis peptidique mentionnés auparavant seront de nouveau utilisés.
50
Schéma 3 : plan de synthèse pour le mime i-motif F
La première étape consiste à lier le premier oligonucléotide par le couplage thiol-chloroacétamide (édifice A). Nous avons choisi d’utiliser cette ligation en premier car c’est la moins réactive des trois et c’est celle qui, usuellement, donne les moins bons rendements. Ainsi, en commençant directement par cette réaction, on s’affranchit de ces désavantages pour la suite. Dans un second temps, il s’en suit une première réaction de cycloaddition CuAAC dans le but de former la première boucle sur le cyclodécapeptide (édifice B). Ensuite, une réaction de
diazo-transfert est réalisée dans le but de générer une fonction azoture sur le chassis via une fonction
51 A partir de là, deux possibilités sont envisageables pour former la seconde boucle. Soit
greffer le deuxième oligonucléotide par la ligation oxime (édifice D) et de finir par la
cycloaddition CuAAC (édifice F), soit effectuer la seconde réaction de cycloaddition CuAAC (édifice E) et de finir par la ligation oxime (édifice F). Il est important de préciser qu’au cours de la ligation oxime, une étape de déprotection de la fonction oxyamine doit être réalisée. Ainsi dans la voie B, il sera observé une différence de masse lors de la formation de l’édifice final ce qui n’est pas le cas dans la seconde alternative. Effectivement, dans le cas où l’oximation s’effectue en fin de synthèse, la perte du groupement protecteur de l’oxyamine ainsi que la perte d’eau, intrinsèque à la ligation oxime, sera une preuve de la formation de l’édifice final. Alors que par la voie A, aucun changement de masse n’a lieu lors de la dernière étape, c’est-à-dire lors de la cycloaddition CuAAC ce qui a été problématique auparavant. Ces deux options seront investiguées.