Capítulo 4- Resultados e discussão
4.4 Identificação e quantificação de compostos na biomassa
Para além da produção da biomassa algal, o presente trabalho estabeleceu o objetivo da extração e quantificação dos pigmentos da biomassa, nomeadamente os carotenoides. Após extração, seguindo o procedimento descrito na parte experimental procedeu-se à identificação e quantificação dos componentes, utilizando cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa, para além de “díodo-array”. Neste monitoraram-se especificamente os seguintes comprimentos de onda: 440 nm, 460 nm e 665 nm, correspondentes a carotenoides e clorofila, para além do sinal global.
Extraíram-se e analisaram-se diferentes amostras de biomassa, nomeadamente do reator flat- plate, reator cilíndrico e reator flat-plate operado em modo contínuo, mas tendo em conta que o padrão do cromatograma era semelhante, esta seção centra-se nos resultados obtidos para a amostra de biomassa do fotobiorreator flat-plate operado em modo contínuo. A figura 4.22 ilustra o cromatograma obtido para o total ion count (TIC) do espectrómetro de massa e a figura 4.23 o total scan do díodo-array.
Figura 4.22 - Espectro TIC para o extrato flat-plate em modo contínuo.
Figura 4.23 - Total diode array Scan para o extrato flat-plate em modo contínuo.
Observando o espectro do TIC é desde logo possível observar uma separação bastante efetiva dos componentes pela coluna, usando as condições de eluição definidas na parte experimental. Observa-se ainda que a linha de base apresenta uma evolução que coincide com a modificação da composição do eluente, notando-se um aumento da linha de base a partir dos 25 minutos com a introdução do acetato de etilo, cuja qualidade não era a mais
apropriada, aumentando o TIC de fundo. As figuras 4.24, 4.25 e 4.26 ilustram o espectro a 440, 460 e 660 nm.
Analisando os gráficos para o comprimento de onda de 440 nm, é possível observar a presença de vários picos, sendo os mais intensos aos 9.49, 11.11, 20.11, 36.33 e 48.93 minutos; a partir dos 50 minutos não se observam picos.
Figura 4.24 - Espectro para o comprimento de onda de 440 nm.
Observando o gráfico para o comprimento de onda de 460 nm, verifica-se que a esmagadora maioria dos picos têm correspondência com o cromatograma dos 440 nm, o que indica que os compostos em presença são maioritariamente os mesmos.
Figura 4.25 - Espectro para o comprimento de onda de 460 nm.
No gráfico para o comprimento de onda 660 nm é possível observar picos aos 9.50 minutos, 11.10 minutos, 36.33 minutos e 49,80 minutos, alguns coincidentes com os observados nos cromatogramas anteriores.
Figura 4.26 - Espectro para o comprimento de onda de 665 nm.
Fazendo a análise dos três gráficos e comparando com os dados na literatura, é possível identificar alguns compostos. Um desses compostos é a clorofila A, que é observável nos
gráficos de 440 e 665 nm aos minutos 11.10 e 36.33; a sua identificação é possível já que a literatura indica que a clorofila A apresenta dois picos de absorvância a 440 nm e a 670 nm não se verificando esse composto nos comprimentos de onda intermédios[96]. O composto foi confirmado analisando o seu espectro de massa e comparando com os valores tabelados por Rivera et al. [97]. O espectro de massa deste composto encontra-se abaixo, sendo que corresponde ao ião molecular 893 m/z.
Figura 4.27 - Espectro de massa para o instante 36.33 minutos.
Aos 20.10 minutos é possível identificar o composto luteína. Este composto foi confirmado através dos resultados da espectrometria de massa. Na figura 4.28 encontra-se espectro de massa obtido no âmbito deste trabalho, com o ião molecular 568 m/z, fragmentos e adutos, que compara com os valores tabelados [97].
Figura 4.28 Espectro de massa para o instante 20.11 minutos.
Outro composto identificado foi o β-caroteno. Este composto é eluído ao minuto 48.92 dos três gráficos. A massa deste composto é 536.9 g/mol, que corresponde a um ião molecular da ordem dos 536 m/z. Este composto foi confirmado pela análise do seu espectro de massa nesse instante e confirmado com os valores de massa indicados na literatura [97]. Na figura 4.29 podemos encontrar o espectro de massa deste composto. Deve referir-se que o equipamento apresenta em geral um deslocamento sistemático no valor das massas entre 0.2 e 0.3 acima do verdadeiro, mesmo após calibração.
Figura 4.29 - Espectro de massa para o instante 49.80 minutos.
Aos 9.48 minutos é possível identificar um composto que possivelmente é fucoxantina e aos 31,22 minutos parece ser clorofila B. Contundo a confirmação deste composto não foi possível.
A partir dos dados obtidos foi possível realizar a quantificação de alguns destes compostos com recurso a reta de calibração de padrões comerciais. Neste caso foi possível realizar a quantificação de dois compostos, β-caroteno e Luteína através do uso de padrões astaxantina e β-caroteno comerciais. As retas de calibração para a astaxantina e β-caroteno encontram-se nas tabelas 4.3 e 4.4. Os gráficos das retas de calibração encontram-se nas figuras A1 e A2 em anexo.
Tabela 4.3 Reta de calibração da astaxantina.
Retas Calibração Declive Ordenada na origem R2
Calibração 0,0562 0,1971 0,9989
Tabela 4.4 Reta de calibração de β-caroteno.
Retas Calibração Declive Ordenada na origem R2
Calibração 0,1052 0,0623 0,9882
Tabela 4.5 - Quantidade de luteína e β-caroteno extraído.
Reator Luteína β-caroteno
mg carotenoides/g base seca mg carotenoides/g base seca
Flat-plate 1,35 0,6
Cilíndrico 0,99 0,43
Flat-plate continuo 3,8 1,57
Os resultados para a luteína assim como os valores de β-caroteno parecem estar dento dos valores indicados na literatura[98]. No caso dos valores de luteína obtidos no reator Flat-plate em modo contínuo estes parecem estar dentro dos valores máximos obtidos experimentalmente para este composto na espécie Chlorella Vulgaris.
Dos resultados da tabela 4.5, observa-se que a biomassa produzida em diferentes condições conduz a diferenças muito significativas nos teores de carotenoides. O reator cilíndrico operado de forma descontínua para biomassa recolhida ao cabo de 70 dias de cultivo, com uma concentração de 1,33 g/L, é aquele que gera biomassa com menor quantidade de luteína e β-caroteno, obtendo 0,99 e 0,43 mg/g base seca respetivamente. Tal pode ser devido à menor luminosidade efetiva sentida pela biomassa neste fotobiorreator já que a sua área volumétrica de captação de luz é baixa (114,4 cm2/L) e a concentração de biomassa
relativamente elevada, que conjuntamente com a limitação de azoto e fósforo levaram à produção de menores quantidades destes dois compostos[99][100]. O reator Flat-plate obteve 1,35 mg de luteína/g base seca e 0,6 mg β-caroteno /g base seca. Estes valores mais elevados, quando comparados com os do reator cilíndrico, advém do facto de este reator ter maior área/volume (350cm2/L) quando comparado com o reator cilíndrico (114,4 cm2/L) e
também menor concentração de biomassa algal. O reator que obteve os melhores resultados foi o reator Flat-plate em modo de operação contínuo; este reator obteve 3,8 e 1,57 mg carotenoides/g base seca de luteína e β-caroteno respetivamente. Tal facto pode dever-se à não limitação de nutrientes no meio, tais como azoto e fósforo, quando comparando com os outros dois reatores, e de igual forma ao anteriormente regista para a produtividade de biomassa. Este facto parece ajudar à acumulação destes compostos como indicado por J. A. Del Campo et al.[101].