A substância 3 foi isolada no estudo fitoquímico das folhas de T. ‘Murcott’, conforme descrito no ITEM 3.4.5. No entanto, seu espectro de RMN
1
H foi feito em DMSO por apresentar maior solubilidade e por existirem relatos na literatura utilizando este solvente, portanto, para efeito de comparação, foi
refeito o espectro do padrão em RMN 1H (600 MHz), desta vez utilizando
MeOD como solvente em tubo capilar (5 mm d.i.).
A substância 3 foi identificada como sendo a Apigenina-7-O- rutinosídeo por apresentar deslocamentos químicos idênticos ao padrão analisado, sua comprovação foi feita mediante comparação do espectro do padrão ao espectro de 2TFa (Folha com sintomas de T. ‘Murcott’ de 3,5 cm), como pode ser observado nas FIGURAS 4.67-4.69.
Resultados e discussões
FIGURA 4.67 - Identificação da Substância 3 por comparação entre os Espectros de RMN 1H de 2TFa: Folhas com sintomas de T. ‘Murcott’ de 2,5 cm e Padrão de Apigenina-7-O- rutinosídeo.
FIGURA 4.68 - Ampliação dos Espectros de RMN 1H de 2TFa: Folhas com sintomas de T. ‘Murcott’ de 3,5 cm e padrão de Apigenina-7-O-rutinosídeo.
2TFa
Apigenina 7-O-rutinosídeo
Apigenina 7-O-rutinosídeo 2TFa
Resultados e discussões
169
FIGURA 4.69: Ampliação dos Espectros de RMN 1H de 2TFa: Folhas com sintomas de T. ‘Murcott’ de 3,5 cm e padrão de Apigenina-7-O-rutinosídeo.
A substância 4 não foi isolada pura no estudo fitoquímico, sendo obtida como minoritária em uma mistura com Apigenina-7-O-rutinosídeo e sua determinação estrutural foi feita por RMN em uma e duas dimensões e por LC- MS. A comparação dos espectros da mistura das substâncias 3 e 4 feito em MEOD com o espectro de 2TFa encontra-se nas FIGURAS 4.70-4.72.
FIGURA 4.70 - Espectros de RMN 1H de 2TFa: Folhas com sintomas de T. ‘Murcott’ de 3,5 cm e da mistura de Apigenina-7-O-rutinosídeo com 4.
Apigenina 7-O-rutinosídeo 2TFa
2TFa
Resultados e discussões
FIGURA 4.71 - Ampliação dos Espectros de RMN 1H de 2TFa: Folhas com sintomas de T. ‘Murcott’ de 3,5 cm e padrão de Apigenina-7-O-rutinosídeo.
FIGURA 4.72 - Ampliação dos Espectros de RMN 1H de 2TFa: Folhas com sintomas de T. ‘Murcott’ de 3,5 cm e padrão de Apigenina-7-O-rutinosídeo.
A análise inicial do espectro de RMN 1H (FIGURA 4.73) da
mistura sugeriu-se que a substância minoritária apresentava dois dubletos em 7,33 (2H, J= 8,4) e δ 6,82 (2H, J= 8,4) e um possível duplo dubleto em 6,18
2TFa 2TFa
3 e 4 3 e 4
Resultados e discussões
171
mesmo padrão de substituição da Apigenina no anel B, visto que os carbonos diretamente ligados aos hidrogênios (H-2’, H-6’) e (H-3’, H-5’) da majoritária apresentam deslocamento químico similar aos carbonos diretamente ligados aos hidrogênios em δ 7,33 e δ 6,82, respectivamente, sugerindo que estes hidrogênios tratavam-se de H-2’, H-6’ e H-3’, H-5’ da minoritária. Outra informação importante fornecida pelo espectro de HSQC (FIGURA 4.76) foi que o sinal em δ 6,18 (2H) apresentava correlação com dois carbonos com deslocamento químico diferentes, indicando que aquele sinal sugerido anteriormente como um dublo dubleto tratava-se, na verdade, de dois dubletos em δ 6,17 e δ 6,19 (J = 1,8), que foram atribuídos aos hidrogênios H-6 e H-8, respectivamente do anel A. Esta informação indica que a substância 4 e a Apigenina apresentam o anel A com o mesmo padrão do substituição, no entanto, com deslocamento químico bem distintos, que pode ser justificada pela possível diferença no anel C destas duas moléculas.
O esqueleto do anel C de uma flavanona para o composto
minoritário foi confirmado no espectro de RMN 1H (FIGURA 4.73) pela
presença de sinais característicos na região de hidrogênios alifáticos: δ 3,17 (dd,
J = 17,2 e 12,4 Hz), δ 2,77 (dd, J=17,2 e 2,4 Hz) e um duplo dubleto em δ 5,41
(J = 12,4 e 2,4 Hz), que foram atribuídos aos hidrogênios H-3α, H-3β e H-2, respectivamente. O acoplamento geminal entre os hidrogênios alifáticos (H-3α e H-3β) e o acoplamento entre os hidrogênios H-3α e H-3β com o hidrogênio H-2 é observado no mapa de contorno COSY (FIGURA 4.78).
O mapa de contorno COSY (FIGURA 4.78) também apresentou correlações para a substância minoritária que indicam a presença de unidades de açúcar na estrutura da molécula. Por esta substância se apresentar em pequena quantidade, nem todas as correlações para os hidrogênios glicosídicos foram observadas. No entanto, algumas correlações relatadas na FIGURA 4.78 indicam a presença das unidades glicose e raminose, com acoplamentos semelhantes aos observados para a Apigenina 7-O-rutinosídeo. Mesmo não
Resultados e discussões
sendo observado o hidrogênio anomérico da glicose, provavelmente por ter sido suprimido juntamente com o sinal da água, é possível sugerir a presença desta unidade de açúcar devido as correlações características da mesma observadas no mapa de contorno COSY (FIGURA 4.78). O mapa de contorno HMBC (FIGURA 4.79) somente apresentou correlações para a substância majoritária, deixando algumas dúvidas sobre a estrutura da molécula. Diante desta dificuldade, foi utilizada a Cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas (LC-MS/MS) para a determinação estrutural da substância minoritária.
Através do experimento por HPLC-UV/MS adquirido no modo Full Scan negativo foi possível observar no tempo de retenção de 4,06 min a substância Apigenina-7-O-rutinosídeo, que deu origem ao íon pseudo-molecular [M - H]- = 577 (FIGURA 4.81). No experimento de íons fragmentos de m/z = 577 constatou-se a perda de 308 u.m.a (glicona) com o surgimento de um fragmento de m/z 269 (aglicona), indicando a perda simultânea de uma glicose e de uma raminose (FIGURA 4.82).
A FIGURA 4.83 apresenta o cromatograma de íons extraídos para os analitos de interesse. Foi possível identificar o composto minoritário no tempo de retenção de 4,24 min que deu origem ao íon pseudo-molecular [M -
H]- = 579. No experimento de íons fragmentos (FIGURA 4.84) de m/z = 579
constatou-se a perda de 308 u.m.a (glicona) com o surgimento de um fragmento de m/z 271 (aglicona), sendo possível observar semelhanças no perfil de fragmentação destas duas substâncias, indicando similaridades nas estruturas dos flavonoides, sendo sugerido que a única diferença entre ambas seria a ausência da ligação dupla entre C-2 e C-3 no composto minoritário e o composto em questão seria a flavanona Narirutina. No entanto, existe a