3.1. Introdução
O imageamento por espectrometria de massas (mass spectrometry imaging – MSI), consiste na combinação entre a informação molecular com a distribuição espacial, proporcionando diferenciar estruturas (tecidos) de acordo com suas diferentes composições moleculares.49 A importância do MSI pode ser dimensionada pela Figura 30 que mostra sua crescente aplicação com o decorrer dos anos.
Figura 30. Número de publicações em MSI. (Web of Science: 28/01/2016_ mass spectrometry e imaging).
Suas primeiras aplicações foram na década de 70 com a fonte de ionização SIMS (secondary ion mass spectrometry), uma técnica que permite análises tridimencionais e com alta resolução espacial. Porém, apresenta algumas desvantagens como a faixa de massa ionizável (ioniza moléculas de baixa massa molecular) e a alta fragmentação dificultando a identificação das moléculas precurssoras.50
Essa limitações foram sanadas com a fonte de MALDI, que permite a ionização sem fragmentação e uma alta faixa de massa, permitindo a análise desde lipídeos até proteínas. Seus principais inconvenientes são espectros com muito ruído abaixo de 600 Da, o que dificulta a análise de lipídeos de baixa massa molecular. A escolha da matriz também é um importante fator a ser considerado, pois, pode influenciar nas classes de moléculas ionizadas.51
Entretanto ambas as técnicas, SIMS e MALDI, necesssitam de um sistema de ionização sob vácuo, e dessa forma aparatos elaborados e sofisticados são necessários. Uma alternativa para essas técnicas veio com o surgimento de novas técnicas de ionização ambiente como a fonte DESI, que também possibilita a realização de uma análise mais rápida.52
Apesar de não ter o poder de resolução espacial que a fonte SIMS possui e a capacidade de ionizar moléculas de alta massa molecular que a fonte de MALDI tem, DESI apresenta uma vantagem muito significante que é a análise em tempo real, devido ao pouco preparo requerido para análise, característica que proporcionou a aplicação desta técnica em diagnósticos na área clínica de oncologia simultaneamente à intervenção cirúrgica.53
Nos estudos de MSI com fontes de ionização ambiente em tecido animal, algumas classes de compostos se destacam, como ácidos graxos (AGs), triglicerídeos (TAGs) e fosfolipídeos (FLs), principalmente pela importância metabólica dessas moléculas (Figura 31).54
Impulsionado pelo alto desempenho e praticidade, recentemente diversas fontes de ionização ambiente vêm sendo desenvolvidas, sempre buscando a ionização de novas classes de compostos, maior poder de resolução espacial, e outros fatores que possam aumentar a eficiência e o campo de atuação dessas fontes de ionização ambiente. Dentre essas a fonte de EASI tem se mostrado eficiente para moléculas que não dependem diretamente da acidez ou basicidade, ou seja, moléculas que já apresentam carga (cátions e ânions) são favorecidas por essa técnica em comparação à fonte de DESI.55
Janfelt e Nørgaard 55 reportaram um estudo comparativo entre DESI e EASI. A fonte EASI empregada nesse estudo foi uma adaptação da fonte DESI, mesma fonte, porém, sem voltagem aplicada ao capilar de formação do eletrospray. Para todas as amostras analisadas em seus estudos a EASI apresenta resultados inferiores aos da DESI quanto ao número de íons detectados, e com intensidade muito inferior com exceção dos corantes Azul Básico 7 e Rodamina B. Os autores concluem que a fonte EASI teria menor eficiência de ionização que a fonte DESI. Esse trabalho almeja comparar DESI e EASI, sendo utilizada a fonte de EASI propriamente e não a fonte de DESI adaptada.
3.2. Parte Experimental
Preparo dos Padrões
Foram preparadas soluções equimolares dos padrões dos AGs (oleico, linoleico e linolénico), TAGs (trioleína, tripalmitina, triestearina e trilinoleína), e FLs (fosfatidilcolina - ovo, esfingomielina - porco, 1-palmitoil-2-oleoil-sn-3-fosfocolina e 1,2-dipalmitoil-sn- glicero-3-fosfocolina) e feitos spots de 2 µL nas superfícies (vidro e papel).
Preparo do Corte Histológico
Para as análises de tecido cerebral, o tecido foi previamente congelado e em seguida feito cortes histológicos de 14 µm com o criostato LEICA CM1900, também foram utilizados vidro e papel como suportes para a análise.
Tabela 5. Condições padrões utilizadas na aquisição dos espectros de massas para as fontes DESI e EASI
Parâmetro DESI EASI
Capilar Interno* diâmetro interno (µm) 50 100
Capilar Interno* diâmetro externo (µm) 150 200
Capilar Externo* diâmetro interno (µm) 250 373
Capilar Externo* diâmetro externo (µm) 350 565
Vazão do Gás volume (L.min-1) 0,65 2,5
Vazão do Gás pressão (psi) 160 110
Vazão do Gás área (mm2) 0,0314 0,0776
Gás de Nebulização velocidade (m.s-1) 350 536
Voltagem do Spray (kV) modo negativo modo positivo
-3,2 +5,0
0 0 Vazão do Solvente (µL.min-
1 ) papel vidro 20 3 20 3 *Silica fundida 3.3. Resultados e Discussão
Primeiramente realizamos análises dos padrões de Ags, TAGs e FLs separadamente e suas respectivas misturas por MSI, nas melhores condições de vazão do solvente em cada um dos dois suportes: papel e vidro, em ambas as fontes: DESI e EASI (Figuras 32, 33 e 34), a fim de avaliar a fonte de ionização. Para esse estudo spots de cada padrão e seu respectivo mix foram aplicados no suporte e feito a análise.
Figura 32. MSI dos padrões de AGs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d) EASI, sendo à direita o mix dos padrões.
Figura 33. MSI dos padrões de FLs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d) EASI, sendo à direita o mix dos padrões.
Figura 34. MSI dos padrões de TAGs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d) EASI, sendo à direita o mix dos padrões.
É possível observar que ocorre supressão iônica similar, tanto com DESI quanto com EASI, e a intensidade relativa dos compostos é muito semelhante. Para os AGs e os TAGs, o EASI apresenta maior arraste (dispersão lateral), principalmente quando utilizado o vidro como suporte, devido às características dos analitos, em contrapartida para os FLs tanto DESI quanto EASI fornecem excelentes resultados (alta resolução lateral).
Em seguida comparamos os perfis das misturas equimolares de AGs (Figura 35), FLs (Figura 36) e TAGs (Figura 37).
Figura 35. Espectros de ESI(-) – MS dos padrões de ácidos graxos em misturas equimolares, onde A) DESI-vidro, B) EASI-vidro, C) DESI-papel, D) EASI-papel.
É possível observar o alto grau de similaridade entre os espectros da Figura 35 A) e B), tanto pelos íons produzidos quanto pela intensidade relativa dos mesmos. Quanto a 27 C) e D), temos uma pequena inversão entre os íons base, m/z 293.0 e 281.1 respectivamente, porém o perfil dos íons é o mesmo e com intensidades relativa semelhantes.
Figura 36. Espectros de ESI (+) – MS dos padrões de fosfolipídeos em misturas equimolares, onde A) DESI-vidro, B) EASI-vidro, C) DESI-papel, D) EASI-papel.
Na Figura 36, podemos observar que também existe um alto grau de similaridade quando utilizado o vidro como suporte, como mostrado em A) e B), com predominância dos adutos de Na+ sobre as espécies protonadas, sendo que utilizando DESI, as intensidades realtivas das espécies protonadas é ligeiramente maior.
Quando foi utilizado o suporte papel Figura 36 C) e D), foi observada uma maior divergência em relação às intensidades relativas do íons, enquanto a fonte DESI 28 C) apresentou predominância de espécies protonadas a fonte EASI D) apresentou um espectro com intensidades mais equilibradas de espécies protonadas e sodiadas, porém, com leve preferência por adutos de Na+. Algumas espécies potassiadas também foram detectadas.
Figura 37. Espectros de ESI (+) – MS dos padrões de triglicerídeos em misturas equimolares, onde A) DESI-vidro, B) EASI-vidro, C) DESI-papel, D) EASI-papel.
Podemos observar na Figura 37 alta similaridade dos perfis. A exemplo dos demais padrões, para ambos os suportes (vidro e papel), foram identificadas apenas espécies amoniadas ou sodiadas. Adutos de Na+ são os íons base em 29 A) e B), m/z 901.7 em ambos espectros, e observou-se alta similaridade entre as intensidades relativas dos íons. Por outro lado 29 C) e D) apresentam predominância de espécies
amoniadas, com inversão de íon base do espectro, m/z 896.8 e 902.8 respectivamente.
A intensidade absoluta dos íons foi calculada para analisar a eficiência de ionização em ambas as técnicas (DESI e EASI) (Tabela 5). Para a comparação de
intensidade absoluta de cada espectro foi selecionada a corrente total iônica (TIC) de três corridas da análise de MSI, a corrida central de cada análise, 1 mm acima e 1 mm abaixo da mesma. Foi selecionado para esse estudo o íon base.
Tabela 6. Espécies detectadas em cada espectro, íons base e médias das intensidades absolutas dos íons base de cada espectro, das diferentes misturas de padrões em seus respectivos suportes.
Padrão Suporte Técnica
Espécies
identificadas Íons mais intenso
1 mm antes do centro Centro 1 mm depois do centro Média AGs (-) Vidro
DESI - H+ 281.1 (M-H)+ 1,96E+06 1,48E+06 1,26E+06 1,57E+06
EASI - H+ 281.1 (M-H)+ 1,61E+07 1,33E+07 1,35E+07 1,43E+07
Papel
DESI - H+ 293.0 (M-H)+ 1,23E+05 1,50E+05 1,19E+05 1,31E+05
EASI - H+ 281.1 (M-H)+ 5,28E+06 5,86E+06 7,37E+06 6,17E+06
FLs (+)
Vidro
DESI H+ ,Na+ 782.6 (M+Na)+ 6,28E+05 5,84E+05 5,81E+05 5,98E+05
EASI H+ ,Na+ 782.6 (M+Na)+ 5,01E+05 1,79E+06 2,55E+05 8,49E+05
Papel
DESI H+ ,Na+ ,K+ 760.6 (M+H)+ 4,15E+05 3,41E+05 5,56E+05 4,37E+05
EASI H+ ,Na+ ,K+ 782.6 (M+Na)+ 3,17E+05 3,79E+05 3,67E+05 3,54E+05
TAGs (+)
Vidro
DESI NH4
+
,Na+ 901.7 (M+Na)+ 6,45E+06 6,69E+06 7,09E+06 6,74E+06
EASI NH4+ ,Na+ 901.7 (M+Na)+ 3,32E+06 3,66E+06 3,94E+06 3,64E+06
Papel
DESI NH4
+
,Na+ 896.8 (M+NH4)+ 4,77E+05 3,29E+05 3,78E+05 3,95E+05
EASI NH4
+
,Na+ 902.8 (M+NH4)+ 2,52E+06 2,50E+06 2,49E+06 2,50E+06
De acordo com a Tabela 6 podemos observar que as intensidades absoluta das triplicatas não apresentam uma variação grande para a maioria das corridas (apenas a fonte EASI nas análises de AGs no suporte vidro apresentou uma variação de 10x entre as intensidades). Os AGs tem intensidades superiores em 10 e 50 vezes para os suportes vidro e papel respectivamente, quando utilizada a fonte EASI. Para FLs, DESI e EASI apresentam valores muito semelhantes. Para os TAGs, houve uma discrepância entre os suportes, no vidro a DESI apresentou intensidade ligeiramente maior (2 vezes), já para o papel a EASI obteve intensidade 6 vezes maior.
Pôde-se observar uma predominância de adutos de Na+ nos TAGs no vidro, em relação às preferência por espécies amoniadas no papel. Quanto aos PFs, prevalecem íons Na+, o que pode se dar pela melhor coordenação entre as carbonilas e o cátion, devido a seu raio atômico. A formação de espécies amoniadas poderia ocorrer com a mesma estabilidade que nos TGs, porém nesse caso temos uma interação íon-molécula e não mais iônica.
A Figura 38 mostra um estudo de caso, no qual dois cortes histológicos de cérebro de rato foram submetidos às análises de DESI e EASI nos modos positivo e negativo.
Figura 38. MSI de cérebro de rato: a) e b) m/z 782.540, e) e f) m/z 683,504, c), d), g) e h)
m/z 303,208.
Nos estudos de caso, é possível visualizar algumas falhas durante as corridas, porém a resolução espacial em ambos suportes com ambas as fontes de ionização foram bons, além de que a ionização do EASI sob baixa vazão no suporte vidro não afetou seu desempenho, assim como a alta vazão no suporte papel não diminuiu a resolução espacial.
3.4. Conclusão
Nesse estudo comparativo entre as fontes de ionização DESI e EASI, foi possível definir que a configuração da fonte de ionização foi o fator determinante para a ionização.
A fonte EASI foi tão eficiente quanto ou melhor que a fonte DESI, em realação às intensidades absolutas, o grau de supressão iônica e o perfil de ionização relativa.
O estudo de caso comprova que o EASI pode ser empregado no MSI, sem perda da qualidade de informação, com resolução espacial mesmo sob alta vazão de solvente, uma vez que a dessolvatação é alta o suficiente para evitar a formação de um spot grande.