Impacto das mudanças pós-traducionais na interação TbEIF4E3/ TbEIF4G4

A identificação da interação de proteínas em complexos estáveis em um sistema celular pode ser alcançada através do procedimento de imunoprecipitação, no qual a proteína alvo e seus parceiros podem ser isolados através da ligação dessas moléculas a ligantes específicos imobilizados em suportes insolúveis. Para isso, lisados celulares foram incubados com uma suspensão de anticorpos específicos para a proteína de interesse, ligados na proteína A sefarose e para controle negativo do experimento esses lisados também foram incubados com soro pré-imune na presença da proteína A sefarose. Esse procedimento foi realizado para imunoprecipitar o TbEIF4E3. Como pode ser observado na figura 14, a imunoprecipitação dessa proteína foi bem sucedida, e adicionalmente foi possível verificar que o TbEIF4G4 co- imunoprecipitou com o TbEIF4E3. Como ambas as isoformas do TbEIF4G4 foram encontradas no imunoprecipitado é possível sugerir que a sua fosforilação não impede a sua associação com o TbEIF4E3.

54

Figura 16. Imunoprecipitação do TbEIF4E3. O TbEIF4E3 foi completamente depletado do lisado, demonstrando que toda a proteína foi imunoprecipitada. Ademais, na imunoprecipitação do TbEIF4E3, também foi detectada a presença do TbEIF4G4, sendo também possível visualizar na imunoprecipitação dessas proteínas suas isoformas fosforiladas. IP C-= imunoprecipitação do controle negativo; IP TbEIF4E3= imunoprecipitação do fator TbEIF4E3; LIS APÓS IP C-= lisado após imunoprecipitação do controle negativo; LIS APÓS IP

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5

5..DDiissccuussssãão o

O controle da expressão gênica em T. brucei e em outros kinetoplastídeos baseia-se amplamente em alterações nos níveis dos transcritos, cujos níveis são regulados através da estabilidade e degradação dos mRNAs, e possivelmente também em alterações no seu padrão de tradução (Clayton, 2002). Estudos prévios em Leishmania e Trypanosoma sugerem que, enquanto diferenças na abundância de transcritos possam ser quantificadas ao longo da diferenciação celular, essas mudanças não são tão pronunciadas quanto em organismos que regulem a sua expressão gênica através da iniciação da transcrição, e a porcentagem de genes cujos níveis de mRNAs variam ao logo do ciclo de vida é bem menor que a de proteínas (10%) (McNicoll et al., 2006). Por outro lado, , até o momento poucas informações foram obtidas no âmbito da regulação em nível pós-traducional, apesar de ser um dos mecanismos de maior relevância dentre os aspectos da biologia desses parasitas. É possível que o grande número de homólogos dos fatores de iniciação eIF4E e eIF4G e as modificações pós-traducionais presentes nestes fatores possam acrescentar outras vias pelas quais a expressão gênica pode ser regulada nesses organismos.

Através da análise da expressão dos fatores TbEIF4E1, TbEIF4E3 e 4 e TbEIF4G4 e 5, nas fases procíclica e sanguínea, foi possível observar que o padrão de expressão deles diferiram ao longo das curvas de crescimento. Dentre as proteínas em estudo algumas se apresentaram sob a forma de no mínimo duas bandas (TbEIF4E3, TbEIF4E4 e TbEIF4G4), nas duas fases do ciclo de vida de T. brucei. Em Leishmania, se observou que a banda de maior peso molecular do EIF4E3 diminui de intensidade ao longo de uma curva de crescimento mas se intensifica novamente na fase estacionária, enquanto que a banda de maior peso molecular do EIF4E4 aumenta ao longo da curva e depois desaparece no final (Pereira, 2008). Este comportamento, entretanto, não foi observado para nenhum dos fatores analisados de T. brucei. Nossos resultados contudo mostraram, de forma mais proeminente, uma segunda banda de maior peso molecular do fator TbEIF4E4 apenas para a forma sanguínea, e somente no ponto de 6 horas da sua curva de crescimento. Já o TbEIF4G4 apresentou-se como duas isoformas ao longo de todas as curvas da forma procíclica e sanguínea, ambas fosforiladas, diferentemente também do que acontece em Leishmania

amazonensis, uma vez que neste organismo foi observado que seu ortólogo é expresso de

maneira estágio específica, sendo sua expressão drasticamente reduzida em células da fase amastigota (Reis,C.R., dados não publicados).

Os fatores TbEIF4E1 e TbEIF4G5 se apresentaram sob a forma de bandas únicas, indicando que aparentemente não são fosforilados, e o perfil de expressão também não variou

56 ao longo das curvas de crescimento realizadas. Dentre todos os homólogos estudados, a proteína menos abundante em células de T. brucei foi o TbEIF4E1 e a mais abundante foi o

TbEIF4E3, tanto na forma procíclica quanto na sanguínea. A quantificação do TbEIF4E1 e do TbEIF4E3 realizada em ambas as formas do T. brucei, é consistente com os níveis de

expressão dessas proteínas visualizados nos experimentos de Western-blot, sendo detectado cerca de 1,5-5x103 e 2-4x104 moléculas/célula na forma sanguínea e 3-8x103 e 5-10x104 moléculas/célula na forma procíclica para o TbEIF4E1 e para o TbEIF4E3, respectivamente (Freire, 2010).

A permanência da expressão de todos os fatores analisados (TbEIF4E1, TbEIF4E3-4,

TbEIF4G4-5 e a TbPABP1) durante as duas fases do ciclo de vida do T. brucei, leva a crer

que essas proteínas são essenciais para a manutenção da homeostasia celular. De acordo com essa afirmação, ensaios de interferência de RNA para avaliar a viabilidade celular após a depleção dos níveis das proteínas TbEIF4G4 e TbEIF4E3 em T. brucei, resultaram em morte rápida da cultura (Moura, 2007; Freire, 2010). A depleção do TbEIF4G4 também induziu mudanças na morfologia celular, resultando em parasitas com formas arredondadas (Moura, 2007).

Através da purificação de fosfoproteínas realizada nesse trabalho foi possível determinar que a presença de mais de uma isoforma nas proteínas alvo (TbEIF4E3, TbEIF4E4 e TbEIF4EG4) na forma procíclica é devido a modificações pós-traducionais do tipo fosforilação. A análise do TbEIF4AI nesse mesmo experimento confirmou que esse fator não é fosforilado. Um recente trabalho também identificou, na forma saguínea do T. brucei, formas fosforiladas do TbEIF4E3 (Nett et al., 2009). A confirmação da fosforilação dessas proteínas em ambas as formas do ciclo de vida do organsimo torna possível pressupor que esta modificação está associada a mecanismos que atuem constantemente na regulação da sua atividade.

Os experimentos de imunoprecipitação aqui realizados demonstraram que ambas as formas fosforiladas do TbEIF4G4 co-imunoprecipitaram com o TbEIF4E3. Em animais após a alimentação, foi observado um aumento na formação do complexo eIF4F, e esse evento foi associado com uma elevação de dez vezes no nível de fosforilação da Ser-1148 do eIF4GI (Vary e Lynch, 2006). È possível que as modificações pós-traducionais observadas no

TbEIF4G4 e em outros fatores possam estar atuando regulando a especificidade de interação

entre parceiros na iniciação da tradução, como já foi visto para a PABP (Le et al., 2000), mas até o momento não está claro como isso ocorre.

Dados na literatura já haviam relatado que uma das isoformas da PABP1 em

57 visualização da TbPABP1 sob a forma de dois spots, dá indícios de que essa proteína também é fosforilada no T. brucei, evidenciando uma conservação nos mecanismos de regulação entre esses parasitas. Estudos com gérmen de trigo têm demonstrado que a PABP no seu estado hiperfosforilado interage mais eficientemente com o eIF4G do que a sua forma hipofosforilada (Gallie et al., 1997; Le et al., 2000; Ma et al., 2009), e aumenta sua ligação cooperativa à cauda poli(A), sugerindo que sua capacidade de homodimerizar é aumentada (Le et al., 2000). Outro estudo demonstrou em células HeLa que durante o período de recuperação após choque de calor houve um aumento na associação da PABP1 com o eIF4G, e um concomitante aumento no nível de fosforilação. Assim o aumento no status de fosforilação da PABP após choques de calor pode ser um passo importante para restaurar os níveis normais de tradução.

Em formas procíclicas do T. brucei, um estudo demonstrou que cerca de 80% das proteínas analisadas através de gel 2-D foram identificadas sob a forma de quatro ou menos spots (ex.: β-tubulina, HSP70), os quais apresentaram mudanças no pI, apesar de a massa molecular apresentar discreta ou nenhuma alteração, o que demonstra que a modificação de proteínas é bastante comum nesse parasita (Jones et al., 2006). De acordo com essas informações, no presente trabalho foi possível visualizar claramente diversas isoformas para os fatores TbEIF4E3 e 4, com pequenas diferenças de massa molecular e pI. Os efeitos da fosforilação do eIF4E de vertebrados na tradução cap-depentente in vitro são insignificantes. Entretanto, a hiperfosforilação forçada do eIF4E através da superexpressão de Mnks em células de mamíferos levou a uma redução nos níveis de tradução (Knauf et al., 2001). A fosforilação também parece produzir uma modesta diminuição na afinidade do eIF4E por mRNA capeados ou análogos de nucleotídeos capeados (Scheper e Proud, 2002) e análises mutacionais indicam que a fosforilação também é necessária para que ocorra transformação celular (Topisirovic et al., 2004).

Em eucariotos superiores, um dos papéis da fosforilação de proteínas é regular vias necessárias para a proliferação e diferenciação celular (Parsons et al., 1993). Uma comparação entre o estágio sanguíneo e o procíclico de T. brucei demonstrou que a atividade e a abundância de muitas proteínas quinases, são reguladas durante o desenvolvimento do parasita (Parsons et al., 1993; Hua e Wang., 1994). Trabalhos adicionais necessitam ser realizados para identificar o real papel da fosforilação dos fatores estudados durante o evento da iniciação da tradução. Ensaios de eletroforese bidimensional comparando as diversas fases da curva de crescimento de cada forma do parasita, a análise da associação dos homólogos com polissomos, e a possível identificação das quinases e fosfatases que atuam regulando o nível de fosforilação podem ajudar a esclarecer as vias de regulação que controlam a

58 expressão gênica desses parasitas. Essas modificações pós-traducionais podem desempenhar papel central na regulação da síntese protéica desses parasitas. Os dados obtidos, juntamente com dados futuros, serão úteis para a identificação de mecanismos conservados na iniciação da tradução entre os tripanossomatídeos e eucariotos superiores.

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6

6..CCoonncclluussõõeess

• As proteínas TbEIF4E1, TbEIF4E3, TbEIF4E4, TbEIF4G4, TbEIF4G5 e a TbPABP1 são expressas nas duas principais formas do ciclo de vida do T. brucei em níveis relativamente constantes.

• TbEIF4E3, TbEIF4E4 e TbEIF4G4 são proteínas modificadas pós-traducionalmente

através da fosforilação e o TbEIF4AI não é fosforilado.

• TbPABP1, TbEIF4E3 e TbEIF4E4 são representados por 2, 5 e 4 isoformas,

respectivamente, enquanto o TbEIF4AI é representado por apenas uma.

• Diferentes fosforilações do TbEIF4G4 não parecem alterar sua interação com o

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