Seis ratos receptores foram selecionados como vetores para implantação das CEMMs diferenciadas em osteoblastos, os quais foram divididos em dois grupos de três, segundo o tratamento.
Todos os procedimentos pré-cirúrgicos e cirúrgicos foram realizados na Sala de Cirurgia do Biotério do LIKA-UFPE, sob condições assépticas, utilizando-se
instrumental estéril e campos descartáveis. Para esterilização destes, foi utilizado o calor úmido (autoclave), sob a pressão de 15 libras e temperatura de 121º C por 30 minutos.
Para anestesia, utilizou-se Cloridrato de Ketamina e o Cloridrato de Xilazina (1:1) aplicados na dosagem de 0,1mL para cada 100g de peso corpóreo por via intramuscular (IM), com um tempo de ação de aproximadamente cinco minutos e um período aproximado de duas horas de anestesia (FERREIRA DA SILVA, 2006).
Enquanto o rato estava anestesiado, sob papel absorvente, foi feita a tricotomia com navalha virgem na região craniofacial, estendendo-se da região occipital até a nasal. Posteriormente, foi realizada uma anti-sepsia com gaze estéril umedecida em Poliviniliodopolidona (PVP-I) a 10%. O animal foi colocado em decúbito ventral numa mesa cirúrgica adaptada com um campo cirúrgico estéril. Para anestesia local, injetou-se 0,1 mL de Cloridrato de Lidocaína a 2% com adrenalina (1:200.000) com o intuito de diminuir o sangramento no trans-operatório e promover um menor desconforto no pós-operatório imediato.
Foi realizada uma incisão paramediana na calvária do rato abarcando pele e periósteo, estendendo-se da região fronto-nasal à protuberância occipital externa, com lâmina n0 15 montada num cabo de bisturi Bard-Parker Nº 3, elevado e rebatido lateralmente mediante um perióstomo tipo Molt Nº 9, expondo os ossos parietais, parte do occipital e do frontal.
Em seguida, foi realizado de forma bilateral uma cavidade circular de 5 mm de diâmetro nos ossos parietais de cada animal, denominadas defeitos críticos (Figura 14A). Para tanto, utilizou-se uma broca trefina calibrada com 5 mm de diâmetro, acoplada numa peça reta, montada em baixa rotação num motor elétrico (Figura 14B). Nos dois grupos, estabeleceu-se como cavidade D a do osso parietal direito e cavidade E a do osso parietal esquerdo.
Figura 14: A.. Defeitos críticos. B. Broca Trefina (esq) e 701 (dir).
Para a realização do experimento, em cada animal foi apontada uma cavidade teste (T) e uma controle (C) através de sorteio, para determinar aleatoriamente a cavidade T (Figura 15). No ato cirúrgico, as cavidades foram identificadas mediante o preenchimento prévio de uma tabela (apêndice A).
Este modelo permitiu pareamento tanto entre os dois grupos como entre as cavidades de um mesmo animal, ou seja, cada rato foi controle e teste (Figura 15).
Figura 15: Esquema mostrando pareamento entre grupos e distribuição aleatória das
cavidades de cada rato. T= Cavidade Teste. C= Cavidade Controle.
Para evitar perfurar o seio sagital e/ou a duramáter, teve-se o cuidado de realizar pressão com os dedos sobre a calota e foi observado também o
aparecimento de uma translucidez no sulco formado pela broca no osso, sendo finalmente removido o fragmento ósseo delicadamente com uma cureta de Lucas.
Durante a confecção dos defeitos críticos, o procedimento foi realizado sob constante irrigação com soro fisiológico 0,9%, evitando-se assim o superaquecimento ósseo e posterior necrose.
Após a realização dos defeitos, a cavidade C foi preenchida apenas com o coágulo sanguíneo enquanto que no grupo CEMM a cavidade T foi preenchida com enxerto de células estromais mesenquimais multipotentes diferenciadas, in vitro, em osteoblastos, numa quantidade de aproximadamente 106/ 10µl de NaCl, utilizando-se o cimento de hidroxiapatita (Bone Source®) como veículo para fixação. No Grupo CEMM-RF a cavidade teste foi preenchida por células diferenciadas in vitro irradiadas pelo campo eletromagnético de rádio freqüência de 60 Hz (Figura 16).
Figura 16: Implante dos osteoblastos.
Após o preenchimento da cavidade teste, o periósteo foi reposicionado e suturado junto ao plano muscular mediante pontos simples com fio de nylon número 5.0 (Somerville®), sendo finalmente suturados os planos superficiais e a pele com o mesmo fio de nylon (Figuras 17A e B).
Figura 17: A. Periósteo suturado. B. Pele suturada.
Imediatamente após a cirurgia, foi realizada a limpeza das feridas e do corpo do animal com PVP-I 10% para evitar a estimulação do canibalismo, devido ao odor exalado pelo sangue presente na ferida cirúrgica.
Os animais foram acondicionados no Biotério do LIKA em gaiolas limpas e com maravalha autoclavada. A calda de cada rato foi coberta com a mesma maravalha com o intuito de mantê-lo aquecido no período pós-operatório, evitando assim, hipotermia corporal, depressão cardio-respiratória e óbito (HARKNESS & WAGNER, 1993; FLECKNELL et al., 1996).
A fim de minimizar o risco de infecção, foi aplicado por cinco dias o antibiótico enrofloxacina 5% por via intramuscular de 24/24h (0,5mL/10Kg). Para o controle da dor pós-operatória, foi aplicado uma dose única de dipirona sódica por via intramuscular no pós-operatório imediato (0,2mL/10Kg) e durante três dias, foi utilizado Ibuprofeno à 4%, diluído na mesma água do bebedouro na razão de 1:25 segundo os protocolos do Biotério do LIKA-UFPE (FERREIRA DA SILVA, 2006).
2.7 Histologia
Os animais foram sacrificados 60 dias após a cirurgia. Para tal, foi administrado o mesmo tipo e a mesma dose anestésica utilizada para a cirurgia e, em seguida, da mesma forma que foi realizada a coleta de medula, os ratos foram eutanasiados com KCl 19,1% intracardíaco.
Após a eutanásia, foi realizada uma tricotomia na região craniofacial do rato e uma limpeza da pele com álcool etílico a 70%. Em seguida, foi efetuada uma incisão trapezoidal, de espessura total, abrangendo os tecidos moles da região parietal, de forma bilateral, com exposição da calota craniana. A ressecção do osso foi efetuada com auxílio de uma broca n° 701 montada em peça reta e acionada por motor elétrico a uma velocidade de 25.000 rpm.
A calota craniana foi removida em sua totalidade tendo como limites os ossos nasais na região anterior, o osso occipital na região posterior, além dos ossos temporais nas regiões laterais do crânio do espécime.
As peças foram fixadas em formol tamponado a 10% em temperatura ambiente e, posteriormente, descalcificadas em solução de ácido nítrico a 0,5% numa temperatura de 41o C por duas horas e meia. Após descalcificação, as calotas foram divididas em duas metades simétricas na região da sutura sagital, correspondendo cada metade a uma hemi-calota direita e uma hemi-calota esquerda. Posteriormente, cada hemi-calota foi cortada no diâmetro do defeito, sendo descartadas as metades anteriores de cada lado, de forma a permitir análise de reparação tecidual de uma extremidade óssea a outra (Figura 18).
Figura 18: Processo de preparação dos defeitos críticos para análise histológica. Adaptado
de Raposo-Amaral et al. (2010).
Cada amostra, contendo uma metade de cada defeito crítico foi colocada num tubo cônico contendo Álcool a 70% e encaminhadas para seu processamento histológico, no qual foram desidratadas em soluções de álcool etílico a 80, 90% e 100%, diafanizadas em banhos de xilol e incluídas em parafina de forma padronizada, que permitiu o posicionamento no micrótomo e o corte da amostra no sentido coronal. Posteriormente, os espécimes foram seccionados em cortes seriados de 5µm de espessura e corados por hematoxilina-eosina (HE) e Tricrômico de Masson (TM).
A análise histológica foi realizada por três patologistas, especialistas na análise de tecido e lesões ósseas, os quais avaliaram as amostras de forma cega. As lâminas foram entregues em caixas identificadas com colorações em Hematoxilina-eosina (H.E) e Tricômico de Masson (T.M). Cada avaliador recebeu uma ficha padronizada (Apêndice B) contendo os seguintes parâmetros histológicos para avaliação: inflamação, tecido ósseo e reparo/fibroplasia (Tabela 1), onde estas foram avaliadas e quantificadas segundo o grau de intensidade (Tabela 2).
Em cada parâmetro histológico, foram identificados os seguintes aspectos para verificação do estágio do processo reparativo: infiltrado inflamatório, tecido de granulação, vasos neoformados, reação de corpo estranho, tecido ósseo maturo e imaturo, osteóide, osteoblastos, fibras colágenas e fibroblastos (Tabela 1).
Tabela 1: Parâmetros e aspectos histológicos avaliados em cada lâmina.
INFLAMAÇÃO REPARO/FIBROPLASIA TECIDO ÓSSEO
Infiltrado inflamatório Fibras colágenas Tecido ósseo maturo
Tecido de granulação Fibroblastos Tecido ósseo imaturo
Vasos neoformados Osteóide
Reação de corpo estranho
Osteoblastos
Tabela 2: Grau de intensidade dos parâmetros histológicos.
2.8 Análise Estatística
Os dados foram submetidos a análise estatística exploratória através do software SPSS (Statistical Package for Social Sciences) for Windows version 15.0, sendo organizados e descritos através de tabela.
INTENSIDADE ESCORES
Ausente -
Leve +
Moderado ++
CAPÍTULO
3
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CAPÍTULO
4
Resultados
ARTIGO ORIGINAL
ESTUDO PILOTO SOBRE O EFEITO DO ONDAS CURTAS
MODULADO NO PROCESSO DE DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS
ESTROMAIS MESENQUIMAIS MULTIPOTENTES EM
OSTEOBLASTOS
THALES HENRIQUE DE ARAÚJO SALES1*; CÉLIA MARIA MACHADO BARBOSA
DE CASTRO2; EDUARDO JOSÉ NEPOMUCENO MONTENEGRO3; RENATA
ALMEIDA RAELE4; DANIELLY CANTARELLI DE OLIVEIRA5; MARIA DO AMPARO ANDRADE6.
1
Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia. Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami – LIKA, Recife, PE, Brasil.
2
Professora Associada 2. Programa de Pós-Graduação de Nutrição e Medicina Tropical. Setor de Microbiologia, Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami – LIKA, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Recife, PE, Brasil.
3
Professor Adjunto do Departamento de Fisioterapia, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Recife, PE, Brasil.
4
Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Biologia Aplicada à Saúde, Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami – LIKA, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Recife, PE, Brasil.
5
Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami – LIKA, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Recife, PE, Brasil.
6
Professora Adjunta do Departamento de Fisioterapia. Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia e Medicina Tropical, Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami – LIKA, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Recife, PE, Brasil.
Título abreviado: Efeito do ondas curtas pulsado na diferenciação de células-tronco Short title: Effect of pulsated short-wave in the differentiation of stem cells
Palavras-chave: Célula-tronco mesenquimal, Campo eletromagnético, terapia celular, diferenciação,
fisioterapia.
Key-Words: Mesenchymal stem cell; Electromagnetic field; Cell therapy; Physiotherapy.
* Endereço para correspondência: Thales Henrique de Araújo Sales
Rua Severino Eneas de Athayde, 357, Altiplano, 58046-140 – João Pessoa – PB - Brasil
Telefone +55 83 9927 9278
Resumo
Objetivo: Avaliar o efeito do campo eletromagnético de rádio frequência modulada em 60 Hz no
processo de diferenciação in vitro de células estromais mesenquimais multipotentes em osteoblastos, através da análise do reparo do tecido ósseo. Materiais e Métodos: Duas cavidades de 5 mm de diâmetro foram realizadas em ambos ossos parietais de seis ratos machos adultos da linhagem
Wistar, os quais foram divididos em dois grupos de três: grupo CEMM (Células Estromais
Mesenquimais Multipotentes) e grupo CEMM-RF (implantação de células-tronco expostas à onda de rádio freqüência modulada em 60 Hz ). Em cada animal foi apontada aleatoriamente uma cavidade teste (T) e uma controle (C). A cavidade C foi preenchida apenas pelo coágulo sanguíneo enquanto que no grupo CEMM a cavidade T foi preenchida com enxerto de células mesenquimais estromais multipotentes diferenciadas, in vitro, em osteoblastos, numa quantidade de aproximadamente 106/ 10µl de NaCl, utilizando-se o cimento de hidroxiapatita como veículo para fixação e no Grupo CEMM- RF as células diferenciadas in vitro foram expostas a um campo eletromagnético rádio freqüência de 60 Hz Hz e densidade de potência de onda de 100 mW/cm2. Após sessenta dias, os animais foram sacrificados e a calota craniana retirada para o processo de análise. As amostras foram submetidas a avaliação histológica mediante três avaliadores de forma cega. Os dados foram submetidos a análise estatística exploratória. Resultados: As cavidades C dos dois grupos apresentaram processo cicatricial intermediário. Não foi observado presença de tecido ósseo neoformado nas cavidades T do grupo CEMM-RF, enquanto que no grupo CEMM houve regeneração tecidual com presença de osso maturo. Conclusão: O campo de rádio frequência modulada de 60Hz emitido pelo aparelho de ondas curtas inibiu a diferenciação das células estromais mesenquimais multipotentes em osteoblastos.
Palavras Chave: Célula-tronco mesenquimal, Campo eletromagnético, terapia celular, diferenciação,
fisioterapia.
Abstract
Objective: To evaluate the effect of electromagnetic field of modulated radio-frequency at 60 Hz in the
process of in vitro differentiation of multipotent mesenchymal stromal cells into osteoblasts, through the analysis of bone tissue repair. Materials and Methods: Two cavities of 5 mm diameter were made in both parietal bones of six male Wistar rats. The animals were divided into two groups: CEMM group (multipotent mesenchymal stromal cells) and CEMM-RF group (multipotent mesenchymal stromal cells exposed to modulated radiofrequency at 60Hz). For each animal, test (T) and control (C) cavities were randomly chosen. The C cavity was filled by blood clot while the T cavity of CWM-RF group was filled with a graft of multipotent stromal mesenchymal cells (106/ 10µl NaCl + hydroxyapatite cement) which were differentiated into osteoblasts in vitro. For CEMM-RF group, the in vitro differentiated cells were exposed to a radiofrequency electromagnetic field of 60 Hz and wave power density of 100 mW/cm2. After sixty days, the animals were sacrificed and the skull removed for the analysis process. The samples were subjected to histological evaluation by three examiners in a blinded fashion. The data were subjected to exploratory statistical analysis. Results: The C cavity of both groups showed intermediated healing process. There was no presence of new bone tissue on T cavity of CEMM-RF group, while tissue regeneration was observed in CMEM group with presence of mature bone. Conclusion: The modulated radiofrequency field at 60 Hz, emitted by the short-wave device, inhibited