Importância das redes sociais, e bases de dados geoespaciais na AB

La région de contrôle de l'opéron carAB d'E.coli et de S.typhimurium comporte deux promoteurs, PI en amont régulé par les pyrimidines et P2 en aval régulé par l'arginine. La sélection de mutants partiellement constitutifs pour l'expression de l'opéron carAB a conduit à l'identification de deux nouveaux éléments de régulation, CarP et PyrH opérant au niveau du promoteur PI de l'opéron carAB.

Nous avons cloné et séquencé le gène carP et montré qu'il est identique aux gènes

xerB et pepA codant pour l'aminopeptidase A. CarP est aussi un élément essentiel du mécanisme de résolution des plasmides du type ColEI qui assure le maintien stable

dans la population (Stirling et al, 1989). CarP/PepA/XerB est une protéine

hexamérique composée de sous-unités identiques de 55 kDa; elle est également impliquée dans la résolution des multimères du plasmide pSClOl (Stirling et al, 1989; Colloms et al, 1996). Comme d'autres aminopeptidases CarP/PepA est impliquée dans la dégradation de polypeptides mais son rôle physiologique n'est pas encore connu. Par contre nous avons montré que la fixation de CarP/PepA sur l'ADN au niveau de sa propre région de contrôle et sur la région de contrôle de l'opéron carAB est nécessaire pour assurer une autorégulation négative du gène carP au niveau de la transcription et un contrôle de synthèse de la CPSase. La fixation de CarP sur deux sites cibles dans la région de contrôle de l'opéron carAB induit un enroulement de l'ADN autour de la grosse protéine hexamérique. CarP et IHF, qui induit une courbure de l'ADN, jouent probablemient ensemble un rôle structural dans l'élaboration du complexe nucléoprotéique qui gouverne l'expression du promoteur PI de l'opéron carAB.

L'interaction de la protéine CarP avec une molécule d'ADN portant au moins deux sites cer ou psi correctement orientés est également nécessaire pour résoudre les multimères des plasmides ColEI et pSClOl. Dans ce mécanisme, CarP joue un rôle structural qui implique une interaction directe avec l'ADN et/ou probablement protéine-protéine avec le répresseur ArgR et les recombinases XerC et XerD.

Le répresseur ArgR, un autre homohexamère de 102 kDa, est un deuxième élément multifonctionnel impliqué dans la régulation de l'expression de l'opéron carAB

et dans la recombinaison spécifique au site cer du plasmide ColEI. Le répresseur ArgR se fixe sur deux boîtes ARG chevauchant le promoteur P2 et empêche stériquement la fixation de l'ARN polymérase. Sur le multimère du plasmide ColEI, ArgR interagit avec deux boîtes ARG des deux sites cer (une boîte par site cer). Cependant, le répresseur ArgR n'est pas impliqué dans le mécanisme de résolution des multimères du plasmide pSClOl indiquant que CarP est l'élément crucial dans la définition de la structure du complexe. Ceci est renforcé par le fait que le profil de bandes obtenu par la DNase I

d'un fragment portant deux sites cer en présence de CarP seule est similaire à celui obtenu en présence de CarP et ArgR (Alén et al, 1997).

La sélection, l'identification et l'analyse de mutants carP nous a permis de caractériser des protéines PepA mutées, portant une seule substitution, défectueuses dans la répression du promoteur PI par les pyrimidines, mais toujours capables de se fixer sur la région de contrôle de l'opéron carAB et toujours actives dans le mécanisme de résolution des formes multimériques du plasmide ColEI. Ce résultat suggère que d'autres interactions, peut-être du type protéine-protéine sont impliquées dans le mécanisme de régulation de l'opéron carAB.

Nous avons également montré que PyrH (UMP kinase) est impliquée directement dans la régulation de l'expression du promoteur PI de l'opéron carAB. En effet, la substitution d'un seul acide aminé dans le mutant pyrH41 (A94E) affecte sévèrement sa fonction régulatrice sans avoir une grande conséquence sur l'activité UMP kinase. Cette fonction régulatrice n'est pas complémentée en augmentant l'activité UMP kinase dans le mutant par introduction de l'allèle pyrH41 ou du gène codant pour la CMP-UMP kinase d'origine eucaryotique sur des plasmides multicopies. 11 est remarquable que l'UMP kinase d'E.coli soit une protéine hexamérique (156 kDa) tandis que les autres nucléotide monophosphate kinases sont généralement monomériques. Nous avons pu détecter une interaction in vitro de la protéine PyrH avec la région de contrôle de l'opéron carAB. Cependant cette interaction ne semble pas être spécifique. Cette fixation de PyrH est encourageante car in vivo, en présence de tous les autres facteurs (protéines et cofacteurs) impliqués dans le mécanisme de répression cette interaction pourrait être bien plus spécifique et forte. En outre, des résultats préliminaires indiquent la possibilité d'interactions protéine-protéine entre PyrH et CarP/PepA. L'UMP kinase (PyrH) constitue donc un troisième élément multifonctionnel à structure homohexamérique impliquée dans la régulation de l'expression de l'opéron carAB.

Le répresseur de la biosynthèse des purines, PurR, réprime l'expression de l'opéron carAB par un facteur deux. Cette régulation serait impliquée dans le maintien de l'équilibre entre les différents nucléotides. Contrairement à la plupart des gènes soumis au contrôle du répresseur PurR ou le site cible chevauche le promoteur ou est situé en aval du promoteur (He et Zalkin, 1994), le site cible de PurR dans la région de contrôle de l'opéron carAB est localisée à -85 pb en amont du site d'initiation de la transcription du promoteur PI entre les sites cibles de la protéines CarP (Lu et al, 1995). Cette exception pourrait être expliquée par l'organisation complexe adoptée par l'ADN en présence de CarP, PyrH et IHF. Ceci est supporté par des expériences de protection

in vivo contre la méthylation par la Dam méthylase du site GATC situé à -106 pb du site

Tableau III-1: résumé des fonctions assurées par les trois protéines homohexamériques, ArgR, CarP et PyrH.

Protéines Fonctions ^{Propriétés communes}

ArgR (XerA)

= XerA, recombinaison cer /Xer répresseur du régulon arginine

réprime le promoteur P2 de l’opéron car AB

CarP

(XerB, PepA)

activité aminopeptidase autorégulation

régulation du promoteur PI de l’opéron car AB

résolution des multimères des plasmides ColEI et pSClOl

homohexamères interaction avec l’ADN

PyrH

UMP kinase (biosynthèse des pyrimidines) régulation du promoteur PI de l’opéron car AB

= SmbA: partition des chromosomes

GATC

Figure III-1: un modèle proposé de la structure du régulateur de l’expression du promoteur PI de Topéron car AB en présence des protéines CarP, PyrH et du complexe d’initiation de la transcription. aNDT et aCDT, domaine N-terminal et C-terminal de la sous-unité a de l’ARN polymérase.

d'initiation de la transcription du promoteur PI. Charlier et al. (1995b) ont montré que la protection de ce site contre l'action de la Dam méthylase en condition de répression est fortement réduite dans les mutants carP, himA (codant pour la sous-unité a de la protéine IHF), pyrH, les mutants affectés dans les sites cibles des protéines IHF et CarP et dans les mutants affectés dans la distance séparant ces différents sites cibles.

Récemment il a été démontré que l'initiation de la transcription au promoteur PI de l'opéron car AB est également contrôlé par un mécanisme de transcription réitérative. Ce mécanisme est indépendant des protéines CarP et IHF et n'assure que 30% de la répression totale exercée par les pyrimidines.

La régulation de l'expression de l'opéron car AB met donc en jeu deux

mécanismes différents et un nombre remarquable de protéines régulatrices (IHF, CarP, PyrH, ArgR et PurR) dont trois, CarP, PyrH et ArgR sont hexamériques et multifonctionelles. Deux d'entre elles, CarP et PyrH possèdent en outre une activité enzymatique. Il y a d'autres exemples de protéines qui combinent une activité enzymatique avec une activité régulatrice au niveau de la transcription: l'opéron put

("proline utilisation") est réprimé par la protéine PutA. Celle-ci catalyse également, au niveau de la membrane, l'oxydation de la proline pour former l'acide glutamique. Ces deux rôles assurés par la protéine PutA requièrent une localisation cellulaire différente (Ostrovsky et al, 1993; Mauro-Pastor et al, 1997). Dans ce contexte. Il est intéressant de noter que PyrH semble préférentiellement être associée à la membrane cytoplasmique, comme démontré par microscopie électronique (O'Barzu, communication personnelle). Un autre exemple intéressant est celui de la protéine XerC d'E.coli une recombinase impliquée dans la recombinaison spécifique au site cer du plasmide ColEI et dans la ségrégation des chromosomes répliqués au cours de la division cellulaire. XerC est homologue considérable au gène sss de Pseudomonas aeroginosa impliqué dans la production de la pyoverdine (50% d'identité) (Hôfte et al, 1994).

Cependant l'intervention de trois protéines hexamériques dans la régulation de

l'expression d'un seul opéron (carAB) constitue un exemple unique chez les

procaryotes (Tableau III-l). Le fait que ces protéines hexamériques interagissent avec l'ADN et affectent sa conformation suggère que l'état hexamérique est nécessaire pour que l'ADN adopte une structure bien définie.

Un des modèles possibles de la formation du complexe régulateur gouvernant la transcription au niveau du promoteur PI de l'opéron carAB est montré dans la figure III-l. Dans ce modèle, qui est basé sur celui proposé par Alén et al (1997) pour l'interaction de CarP/XerB et ArgR avec les sites cer du plasmide dimérique ColEI, chacun des deux hexamères de la protéine CarP interagit avec un site cible, PyrH est placée entre les deux molécules de CarP, et l'ADN s'enroule autour du complexe

CarP-PyrH-CarP de telle façon à placer la protéine IHF près du complexe d'initiation de la transcription. IHF pourrait interagir avec le domaine C-terminal de la sous-unité

a de l'ARN polymérase. Une interaction est également possible entre le complexe CarP-PyrH-CarP et l'ARN polymérase.

La signification biologique des protéines multifonctionnelles impliquées dans la régulation de l'expression des gènes car peut apporter des informations concernant le développement du mécanisme de régulation au cours de l'évolution. 11 est probable que des protéines qui au départ exerçaient une fonction essentielle et interagissent avec l'ADN (réplication, partition, recombinaison....) ont été recrutées pour assurer le contrôle génétique d'autres fonctions cellulaires. ArgR/XerA et particulièrement CarP/ XerB/PepA sont deux exemples d'éléments supposés avoir subit cette diversification de spécificité. La pression sélective menant à un tel transfert de spécificité n'est pas connue mais il est intéressant de noter que l'accumulation de certains métabolites tels que la carbamoyl aspartate, l'acétyl ornithine et l'ornithine conduit à un arrêt de croissance. Cet effet est suffisamment prononcé pour permettre la sélection de mutants auxotrophes pour l'arginine ou les pyrimidines (Glansdorff et al, 1998). v

Afin de progresser d'avantage dans la compréhension du mécanisme de régulation du promoteur PI de l'opèron car AB, l'analyse fonctionnelle des protéines CarP et PyrH ainsi que de la région de contrôle devrait être poursuivie. L'occupation de la région de contrôle en fonction de la composition du milieu de croissance devrait être étudiée in vivo par des techniques de protection dans la souche sauvage et dans des mutants de différents types (pyrH, pepA, ihf...).

Enfin, une reconstitution de la réponse régulatrice in vitro, avec tous les éléments connus à ce jour devrait être tentée; l'observation au microscope électronique de complexes nucléoprotéiques devrait également fournir des informations intéressantes.

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Chapitre IV: MATÉRIELS ET MÉTHODES