A imunoistoquímica é uma técnica que possui grande destaque em detectar
alterações moleculares como prática clínica de exames laboratoriais, unindo os
achados dos estudos da pesquisa básica à rotina de diagnóstico dos pacientes, já que
se trata de uma técnica de custo acessível a muitos laboratórios. Muitas patologias
resultam em produção anormal de moléculas, o que através dos avanços da biologia
molecular, passam a ser detectáveis, permitindo melhor diagnóstico, prognóstico ou
mesmo planejamento do tratamento das doenças.
O princípio básico da imunoistoquímica constitui-se na defesa imunológica
do organismo estimulada pela exposição ao que lhe é estranho. Na resposta
imunológica adquirida humoral os linfócitos B são capazes de desenvolver
anticorpos específicos contra antígenos estranhos, visando sua posterior destruição.
Assim, a imunoistoquímica se baseia no desenvolvimento de anticorpos
específicos (monoclonais) que reconhecem as proteínas de interesse do tecido,
simulando a resposta imunológica. A técnica mais usada para produção de anticorpos
monoclonais consiste na imunização de camundongos com o antígeno objeto de
estudo. Os linfócitos B coletados do baço ou linfonodo do camundongo são
fusionados a uma linhagem tumoral de linfócito B imortalizada (hibridoma). Os
hibridomas cultivados sofrem posteriormente uma triagem buscando os clones que
produzem o anticorpo de interesse (ABBAS et al. 2003).
A técnica de imunoistoquímica é utilizada para detectar a presença de
antígeno nos cortes histológicos de tecidos pelo uso de anticorpo específico para
uma substância insolúvel colorida que se precipita no sítio do corte do tecido onde
está o anticorpo e também, o antígeno, observado posteriormente por microscopia de
luz convencional.
A interpretação diagnóstica através dos métodos imunoistoquímico depende,
na maioria das vezes, da boa qualidade dos espécimes utilizados e da preservação
dos seus antígenos, que requer cuidados prévios ao longo de toda a rotina
histopatológica, incluindo obtenção, o manuseio e a fixação adequados. O uso de
fixadores à base de formaldeído pode alterar, destruir ou “mascarar” alguns
antígenos ou epítopos, dada à sua composição e processo de ligação às moléculas,
formando pontes aldeído-proteína e alterando a estrutura terciária dos antígenos, que
podem prejudicar as ligações entre antígeno e anticorpo (SANTOS et al. 1999).
As amostras fixadas em formalina, especialmente quando não é possível obter
o controle do pH ou do tempo de fixação, requerem recuperação antigênica para a
grande maioria dos epítopos habitualmente pesquisados, já que este processo elimina
as ligações cruzadas entre as moléculas, incluindo entre certas cadeias de
aminoácidos não hidrolisados por digestão química (SANTOS et al. 1999).
A imunoistoquímica é indicada para mutações que resultam em proteína
truncada, como as nonsense, frameshif, splicesite mutations e grandes rearranjos
cromossômicos. Mutações missense mudam a composição da proteína devido a troca
do aminoácido. Os efeitos fenotípicos são em princípio mais drásticos quanto maior
for a diferença na natureza química das cadeias laterais dos resíduos dos aminoácidos
trocados, e também dependem altamente do papel que esse resíduo desempenha na
estrutura e função da proteína, podendo resultar na inativação da proteína, ou em
é incerta, já que testes de funcionalidade para acessar a competência das proteínas de
reparo in vitro não está disponível atualmente. Assim, a muitas das mutações
missense são caracterizadas como “variantes não classificadas”, que não servem, portanto, aos propósitos diagnósticos, já que nestes casos a proteína pode ser
funcionalmente anormal, mas ainda ser detectada na imunoistoquímica (HENDRIKS
et al. 2006a).
As mutações nonsense ocorrem quando a troca das bases gera um códon de terminação, o que geralmente culmina com a formação de uma proteína truncada. As
mutações frameshift ocorrem quando a inserção ou deleção de bases muda a fase de
leitura do DNA, podendo também gerar um códon de terminação prematura e
conseqüentemente uma proteína truncada. As splicesite mutations ocorrem quando
mutações nas regiões de splicing levam a sítios alternativos de splicing podendo
resultar em um processamento errado do RNA.
A grande maioria das mutações nos genes MLH1 e MHS2 resultam em
expressão imunoistoquímica anormal de suas respectivas proteínas (BOLAND 2005;
KIRK 2006). Portanto, outra ferramenta diagnóstica importante é a análise da
expressão imunoistoquímica dessas proteínas. A pesquisa da expressão
imunoistoquímica das proteínas MLH1 e MSH2, no tecido tumoral de pacientes
suspeitos de síndrome de Lynch, tem se mostrado eficaz como exame de
rastreamento para indicação do seqüenciamento do respectivo gene (MÜLLER et al.
2001; BAUDHUIN 2005). Apesar de ainda não haver consenso na literatura sobre a
indicação de investigação do gene MSH6, o número de famílias com mutações
detectadas em MSH6 tem aumentado substancialmente (JIRICNY e NYSTRÖM-
síndrome de Lynch varia bastante de acordo com a população estudada e o número
de pacientes analisados, variando de 6% a 16% (DOVRAT et al. 2005). LINDOR et
al. (2002) encontraram 100% de sensibilidade da imunoistoquímica na detecção de
MSI com amostras de 1.144 pacientes considerados de alto risco para CCR.
Como as proteínas de reparo do DNA formam heterodímeros, padrões de
imunoistoquímica distintos são esperados. O reconhecimento de erros de bases
simples e de loops de inserção e deleção (IDLs) é realizado pelo heterodímero MSH2
e MSH6 (MutSα), enquanto que o heterodímero MSH2 e MLH3 reconhece os IDLs
na falta de MSH6. O heterodímero MLH1 e PMS2 (MutLα) medeia a interação do
reconhecimento do erro e de seu reparo (HALVARSSON et al. 2006). Na falta de
PMS2, a proteína MLH3 é a candidata para formar o heterodímero com MLH1.
Assim, indivíduos podem ser selecionados para a análise de mutação conhecendo-se
qual gene deverá ser testado primeiro.
Os anticorpos utilizados na imunoistoquímica apresentam padrão de
coloração nuclear. Células tumorais apresentando coloração citoplasmática, ausência
ou redução de coloração na presença de células não-neoplásicas com coloração