Indução de anticorpos anti-L2 induzidos pelas proteínas de fusão

Para realizar os ensaios de imunização, todas as soluções contendo as proteínas recombinantes foram previamente submetidas à remoção de lipopolissacarídeo (LPS) (Aida e Pabst, 1990). O ensaio de imunização foi realizado com um total de 14 grupos (12 grupos amostrais e 2 grupos controles) nos quais os animais foram imunizados por via subcutânea com cada proteína recombinante na ausência e presença de adjuvantes (hidróxido de alumínio e monofosforil lipídio A). A estratégia de imunização utilizada está esquematizada na figura 19.

Proteína recombinante Concentração (µg/µL) Produção (mg/L)

L2 HPV 16 0,19 3,8 L2 HPV 18 0,17 3,4 L2 Multimérica 0,2 4,0 ZZ L2 HPV 16 0,21 4,2 ZZ L2 HPV 18 0,31 6,2 ZZ L2 Multimérica 0,2 4,0 ZZ 0,2 4,0

Figura 19. Representação esquemática da estratégia de imunização.

O pool dos soros obtidos na sangria final de cada grupo foi analisado por ELISA para a detecção de anticorpos sistêmicos (IgG presente no soro) contra as proteínas utilizadas na imunização (figura 20). Os grupos imunizados com L2 HPV 16 e L2 HPV-16-adjuvante apresentaram títulos de anticorpos de 1:25600 e 1:51200, respectivamente (figura 20A). A imunização com a proteína L2 HPV 18, induziu altos níveis de anticorpos no grupo que recebeu L2 HPV 18-adjuvante (1:102400). A imunização com a proteína L2 Multimérica induziu baixos níveis de anticorpos com as titulações dos soros variando entre 1:800 e 1:1600.

Figura 20. Titulação de anticorpos IgG anti-L2 após imunização subcutânea de camundongos BALB/c com as proteínas recombinantes. Foram utilizados o pool dos soros de 5 animais de cada grupo. (A) Coating utilizando a proteína L2 HPV-16. (B) Coating utilizando a proteína L2 HPV-18. (C) Coating utilizando a proteína L2 Multimérica.

As análises de indução de anticorpo IgG anti-L2 através de ELISA foram realizados utilizando-se o pool de soros (como mostrado acima) e também com os soros individuais (figura 21). Para a representação gráfica dos soros individuais, o inverso do título foi determinado para cada grupo. A significância estatística da diferença entre os grupos foi avaliada com testes não paremétricos de Kruskal-Wallis, seguido de segundo teste estatístico, Mann-Whitney, para comparação par-a-par entre os grupos (tabelas 4 a 6).

O teste de Kruskal-Wallis apresentou um valor de p igual a 0,0001, indicando que existe heterogeneidade entre as amostras (não mostrado). A comparação par-a-par entre os grupos nos quais foi administrada a proteína L2 HPV 16, não fusionada e fusionada ao domínio ZZ, mostra que o grupo imunizado com a fusão gerou títulos de IgG anti-L2 menores do que os obtidos pelo grupo sem a fusão comm o domínio ZZ (figura 21A). A adição de adjuvante (hidróxido de alumínio e MPLA) às proteínas intensificou a produção de IgG anti- L2, mas com uma diferença significativa nos níveis de anticorpos observada apenas em relação à proteína fusionada. A tabela 4 apresenta os valores de Pvalue obtidos pela comparação par a par entre os grupos imunizados com as proteínas L2 HPV 16 e ZZ-L2 HPV 16.

A comparação entre os grupos imunizados com as proteínas L2 HPV 18 e ZZ L2 HPV 18 mostra que, de maneira semelhante ao caso anterior, a proteína não fusionada induziu nível de anticorpos anti-L2 superiores àqueles obtidos com a proteína fusionada (figura 21B), e que a adição de adjuvante às proteínas intensificou a produção de anticorpos podendo ser observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (tabela 5).

Nos grupos em que foram administradas as proteínas L2 Multimérica e ZZ L2 Multimérica, os títulos de IgG obtidos apresentaram valores próximos não sendo observadas diferenças significativas, sugerindo uma indução de anticorpos de mesma intensidade para todos os grupos (figura 21C).

A imunização com as proteínas mostrou de forma geral que a adição de adjuvantes às proteínas L2 HPV 16 e L2 HPV 18 potencializou a produção de anticorpos do tipo IgG, e que a fusão ZZ não promoveu aumento do nível de anticorpos, ao contrário os níveis de anticorpos do tipo IgG gerados foram mais baixos. Com relação aos níveis de anticorpos induzidos pela proteína L2 multimérica aqueles foram baixos e uniformemente similares entre os grupos.

Figura 21. Indução de IgG anti-L2 após imunização de camundongos BALB/c por via subcutânea com as proteínas recombinantes. (A) Títulos dos soros dos grupos imunizados com as proteínas L2 HPV 16 e ZZ L2 HPV 16 na presença e ausência de adjuvante (hidróxido de alumínio e monofosforil lipídio A), (B) Título dos soros dos grupos imunizados com as proteínas L2 HPV 18 e ZZ L2 HPV 18 na presença e ausência de adjuvante, (C) Títulos dos soros dos grupos imunizados com as proteínas L2 Multimérica e ZZ L2 Multimérica na presença e ausência de adjuvante. (*) diferença significativa (p<0,05), (**) diferença significativa (p<0,01) para o teste Mann-Whitney. ND: absorbância não detectada.

Tabela 4. Valores de Pvalue obtidos através do teste Mann-Whitney para as comparações par-a-par dos

títulos de IgG anti-L2 obtidos no ensaio de imunização utilizando coating com a proteína L2 HPV 16. Os números marcados em vermelho representam diferença estatisticamente significativa (p<0,05).

Coating L2 HPV 16 L2 HPV 16 ZZ L2 HPV 16 L2 HPV 16 + Alum + MPLA ZZ L2 HPV 16 + Alum + MPLA L2 HPV 16 ZZ L2 HPV 16 0,0107 L2 HPV 16 + Alum + MPLA 0,0833 0,0092 ZZ L2 HPV 16 + Alum + MPLA 0,0107 0,0112 0,0092

Tabela 5. Valores de Pvalue obtidos através do teste Mann-Whitney para as comparações par-a-par dos

títulos de IgG anti-L2 obtidos no ensaio de imunização utilizando coating com a proteína L2 HPV 18. Os números marcados em vermelho representam diferença estatisticamente significativa (p<0,05).

Coating L2 HPV 18 L2 HPV 18 ZZ L2 HPV 18 L2 HPV 18 + Alum + MPLA ZZ L2 HPV 18 + Alum + MPLA L2 HPV 18 ZZ L2 HPV 18 0,0532 L2 HPV 18 + Alum + MPLA 0,0092 0,0095 ZZ L2 HPV 18 + Alum + MPLA 0,1251 0,015 0,016

Tabela 6. Valores de Pvalue obtidos através do teste Mann-Whitney para as comparações par-a-par dos

títulos de IgG anti-L2 obtidos no ensaio de imunização utilizando coating com a proteína L2 Multimérica. Os números marcados em vermelho representam diferença estatisticamente significativa (p<0,05). Coating L2 Multimérica L2 Multimérica ZZ L2 Multimérica L2 Multimérica + Alum + MPLA ZZ L2 Multimérica + Alum + MPLA L2 Multimérica ZZ L2 Multimérica 0,1351

L2 Multimérica + Alum + MPLA 0,2636 0,0833 ZZL2 Multimérica+Alum+ MPLA 0,5152 0,1887 0,7972

Os soros dos grupos imunizados com as proteínas L2 Multimérica e ZZ L2 Multimérica foram analisados quanto à reatividade cruzada contra as proteínas L2 HPV 16 e L2 HPV 18 (figura 22). Os soros de todos os grupos foram capazes de reconhecer a proteína L2 HPV 16, e os níveis de reconhecimento foram estatisticamente superiores em relação aos controles (ZZ e hidróxido de alumínio/monofosforil lipídio A). Entre os soros dos grupos imunizados com as proteínas, houve um padrão de reconhecimento com intensidades similares e sem diferença estatística.

Na avaliação de reatividade cruzada contra a proteína L2 HPV 18, apenas os soros dos grupos ZZ L2 Multimérica e ZZ L2 Multimérica-adjuvante produziram reconhecimento superior e com diferença estatística quando comparados aos soros dos grupos controles. Entre os grupos, apesar dos soros ZZ-L2 Multimérica e ZZ-L2 Multimérica-adjuvante apresentarem uma tendência de reconhecimento superior, não foi possível observar diferenças estatísticas entre eles (figura 22B).

Os soros dos grupos imunizados com as proteínas multimérica reconheceram as proteínas L2 HPV 16 e L2 HPV 18, ainda que alguns soros não tenham apresentado reatividade detectável. De forma geral, o reconhecimento da proteína L2 HPV 16 pelos soros foi mais intenso quando comparado ao reconhecimento da proteína L2 HPV 18.

Figura 22. Reatividade cruzada dos soros de camundongos BALB/c imunizados por via subcutânea com as proteínas recombinantes.. (A) Títulos dos soros dos grupos imunizados com as proteínas L2 Multimérica e ZZ L2 Multimérica na presença e ausência de adjuvante (hidróxido de alumínio e monofosforil lipídio A), o coating foi realizado com a proteína L2 HPV 16. (B) Títulos dos soros dos grupos imunizados com as proteínas L2 Multimérica e ZZ L2 Multimérica na presença e ausência de adjuvante (hidróxido de alumínio e monofosforil lipídio A), o coating foi realizado com a proteína L2 HPV 18. (*) diferença significativa (p<0,05), (**) diferença significativa (p<0,01) para o teste Mann- Whitney. ND: absorbância não detectada.