Influência da concentração inicial de substrato

Foram realizados ensaios com concentrações iniciais de substrato entre 21,8 e 210g/L, mantendo-se constantes o pH, a temperatura e a freqüência do agitador em 5,5, 30°C e 7 0 m iir1, respectivamente. Os valores de pH e temperatura foram escolhidos por terem sido definidos como sendo ótimos para o crescimento de Zymomonas mobilis, de acordo com SWINGS e DE LEY (1977). A freqüência do agitador, 70min-1, foi escolhida por promover uma boa agitação do meio e, simultaneamente, não provocar destruição significativa dos flocos (LOPEZ et al., 1993).

Como os ensaios foram realizados a 70min-], não foi possível manter a homogeneidade dos flocos de Z. mobilis, prejudicando, assim, a coleta de amostras representativas para o acompanhamento da variação da concentração de células com o tempo nos diferentes ensaios. Deste modo, as velocidades específicas, essenciais para o estudo cinético de um processo fermentativo, não foram calculadas.

Na Tabela IV.2 são apresentados resultados experimentais obtidos ao fim das fermentações e na Tabela IV.3 os índices de floculação, fatores de conversão, rendimentos e produtividades calculados para este grupo de ensaios.

TABELA IV.2 - Resultados experimentais obtidos ao fim dos ensaios para o estudo da influência da concentração inicial de substrato.

Ensaio 05 18 08 04 12 AS (g/L) 21,8 61,0 95,0 144,0 210,0 AP (g/L) 10,0 29,0 45,0 68,5 100,0 AXt (g/L) 0,72 1,76 2,49 2,29 2,25 AXl (g/L) 0,34 0,53 0,61 0,59 1,59 AXf (g/L) 0,38 1,23 1,88 1,71 0,66 A (U/g) 7,3 10,0 9,5 14,2 14,1 Agt (U/L) 6,25 18,3 24,4 34,08 32,15 Agf (U/L) 3,4 12,9 18,5 25,6 9,6 t (h) 8,8 12,5 12,5 21,0 88,0

TABELA IV.3 - Resultados gerais dos ensaios realizados para o estudo da influência da concentração inicial de substrato.

Ensaio 05 18 08 04 12 iF (%) 55,3 70,5 75,9 75,0 29,8 R (%) 90,2 92,1 92,1 92,1 92,1 Y P/S 0,46 0,47 0,47 0,47 0,47 Y Xt/S 0,033 0,029 0,026 0,016 0,011 Y Xl/S 0,0150 0,0087 0,0064 0,0041 0,0076 Y Xf/S 0,0170 0,0200 0,0200 0,0120 0,0031 yAgt/S (U/g) 0,29 0,30 0,26 0,24 0,15 y a g f/s (U/g) 0,16 0,21 0,20 0,18 0,046 P (g/(L.h)) 1,14 2,32 3,60 3,30 1,14 P Ac t (U/(L.h)) 0,71 1,46 1,95 1,62 0,36 P A ( jp (U/(L.h)) 0,39 1,03 1,48 1,22 0,11

Apesar de não ter sido possível obter os valores das velocidades específicas, tentou-se avaliar o possível efeito inibidor da concentração inicial de substrato pela variação da concentração de glicose com o tempo (Figura IV.5).

Foi observada, no ensaio com 210g/L de concentração inicial de substrato, uma forte inibição, evidenciada por uma fase "lag" de aproximadamente 50h. Por outro lado, é difícil afirmar que nos demais ensaios tenha ocorrido inibição por substrato, uma vez que o patamar existente no início da fermentação parece ser uma tendência natural do processo.

Glicose (g/L)

Tempo (h)

FIGURA IY.5 - Variação da concentração de substrato com o tempo com diferentes concentrações iniciais de substrato (S0).

Como mostra a Figura IV.6, o fator de conversão em células totais (YXt/s)

diminui com o aumento de S0. Esse fato pode ser devido à própria concentração inicial de substrato, inibindo o crescimento, e/ou à inibição pelos produtos finais da fermentação, etanol e C 0 2 (SW1NGS e DE LEY, 1977; VEERAMALLU e AGRAWAL, 1986).

Em estudos realizados no Centro de Desenvolvimento Biotecnológico (dados não publicados) com Z. mobilis CPI e 29191, em concentrações de Sq acima de 180g/L, verificou-se interrupção do crescimento celular, possivelmente devido ou à inibição pelo etanol ou à escassez de algum nutriente do meio. E provável que Z mobilis Zl-81 também apresente este comportamento, podendo-se, assim, explicar os baixos valores de YXt/s no ensaio com Sq = 210g/L.

ROGERS et al. (1982) observaram fatores de conversão em células livres de Z. mobilis ZM4 de 0,032 e 0,018 quando utilizaram 100 e 200g/L de concentração inicial de glicose, respectivamente. Isto mostra que o comportamento de Z mobilis, com relação ao efeito da concentração inicial de glicose sobre o fator de conversão em biomassa, é semelhante para diferentes linhagens.

So (g/ü

FIGURA IV.6 - Fatores de conversão em células totais (YXl/S) em função da concentração inicial de glicose (S0).

Na Figura IV.7 são apresentados os fatores de conversão em células livres (Yxjvs) e células floculantes (Y ^ /s). O fator de conversão em células livres diminui com

o aumento de S0 até concentrações de 144g/L. No ensaio com S0=210g/L foi observado um aumento de Y X l /s- Maiores conversões em células floculantes foram medidas com S0

entre 61 e 95g/L, 0,02 grama de célula por grama de substrato consumido. A definição desta faixa é importante, uma vez que no processo de biotransformação de glicose e frutose em ácido glucônico e sorbitol, respectivamente, apenas as células floculantes são utilizadas.

S 0 (g/L)

FIGURA IV.7 - Fatores de conversão em células livres (YXl/s , A) e floculantes

(Yxf/s , n ) em função da concentração inicial de glicose (S0).

Os maiores índices de floculação (iF), 75,9 e 75%, foram obtidos nos ensaios com concentrações iniciais de glicose de 95 e 144g/L, respectivamente (Figura IV.8). Resultados semelhantes foram encontrados por LOPEZ et al. (1993), quando utilizaram Z. mobilis Zl-81 nas mesmas condições de operação. De acordo com a Figura iV.8, observa-se uma sensível queda de iF no ensaio com S0= 210g/L, devido à alta concentração de células livres no meio.

ip (%)

S 0 (g/L)

FIGURA IV.8 - Índices de floculação (iF) em função da concentração inicial de glicose

(So).

Não foram observadas diferenças significativas nos fatores de conversão de glicose em etanol (YP/S), com qualquer dos valores de S0 testados, como mostra a Figura IV.9. Valores semelhantes de YP/S foram encontrados por ROGERS et al. (1982) e MORTATTI e PARK (1988), com Z mobilis ZM4 e NRLL B-14022, respectivamente, em fermentações em batelada com concentração inicial de glicose de 100 e 200g/L, a 30°C. Esta constância pode ser devida ao fato de que etanol é o produto principal do catabolismo de glicose por Z mobilis, estando sua formação diretamente relacionada com a reoxidação de coenzima (NADPH) a ser utilizada para a produção de ATP na via de Entner-Doudoroff.

A análise conjunta dos resultados mostrados nas Figuras IV.6 e IV.9, Y Xt/s decrescente com o aumento de S0 e YP/S constante, deixa dúvidas com relação ao destino de parte do substrato nestes ensaios. Quanto aos demais produtos do catabolismo de glicose, ainda que não seja proposta deste trabalho discutí-los, não foram verificadas, pelas análises cromatográficas das amostras destes ensaios, concentrações importantes de ácido acético e acetoína.

YP/S

So (g/L)

FIGURA IV.9 - Fatores de conversão em etanol (YP/S) em função da concentração inicial de glicose (S0).

A Figura IV. 10 mostra as produtividades em etanol em função de S0. Sendo etanol um produto importante para a economia do processo, uma especial atenção é dada ao ensaio com S0=95g/L, o qual apresenta a maior produtividade 3,5g/(L.h). ROGERS et al. (1982) alcançaram produtividade de 5,2g/(L.h) e MORTATTI e PARK (1988) de l,87g/(L.h), quando utilizaram Z mobilis ZM4 e NRRL B-14022, respectivamente, nas mesmas condições de operação, sugerindo que a produtividade em etanol está relacionada com a linhagem utilizada.

s0 (g/L)

FIGURA IV.10 - Produtividades em etanol (p) em função da concentração inicial de glicose (S0).

Apesar da relativamente alta produtividade em etanol do ensaio com S o ^ S g /L , a concentração final deste produto, 45g/L (Tabela IV.3), é ainda baixa para a operação de um sistema de destilação de forma econômica. Neste aspecto, destaca-se a concentração de álcool, 100g/L, no ensaio com S0=210g/L, ainda que a produtividade (1,14 g/(L.h)) tenha sido quase 70% menor.

Como já foi discutido neste capítulo, não se sabe ao certo a utilização dada pelas células à parte do substrato consumido durante as fermentações nestes ensaios. Foi observado, porém, que a atividade especifica (A) em glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) tende a aumentar com o aumento de S0 (Figura IV. 11), confirmando os resultados de ZACHARIOU e SCOPES (1986). Este aumento sugere, então, que parte do substrato poderia estar sendo utilizado para a produção de GFOR, embora não seja possível afirmar com certeza, visto que a quantificação da enzima é feita por medida de atividade e não de concentração.

s 0 (g/L)

FIGURA IV.11 - Atividades específicas (A) em função da concentração inicial de glicose

Por ser a enzima GFOR considerada como produto, tornou-se interessante saber qual a atividade enzimática global de células totais (AGT) e floculantes (AGF) obtidas ao fim da fermentação. Foram realizados ensaios prévios de atividade enzimática e verificou-se que as atividades específicas de células totais, livres e floculantes não variavam entre si. Assim sendo, foi possível obter os valores de AGT e AGF multiplicando- se A por XTf e XFf, respectivamente.

A Figura IV. 12 apresenta as atividades globais de células totais (AGT) e floculantes (AGF) em função da concentração inicial de glicose. Observa-se que AGT e Agf aumentam com o aumento de S0 até 144g/L. Com S0=210g/L, AGT mantém-se, aproximadamente, no mesmo valor que no ensaio com S0=144g/L, já que as atividades específicas e concentrações celulares finais foram praticamente idênticas em ambos experimentos. Com relação a AGF, verificou-se, com S0=210g/L, uma substancial queda em comparação com o valor obtido com S0=144g/L, devido ao índice de floculação mais baixo.

s 0 (g/L)

FIGURA IV.12 - Atividades globais de células totais (AGT , O) e floculantes (AGF , □) em função da concentração inicial de glicose (S0).

Analisando-se os resultados ilustrados pela Figura IV. 13, que mostra os fatores de conversão em atividade global de células totais (YAgt/s) e floculantes ( Y Ag f/s), observa-se que os perfis das duas curvas são semelhantes, com os fatores de conversão diminuindo com o aumento de S0, a partir de 61g/L. Com relação aos fatores de conversão em atividade global de células floculantes, destacam-se os ensaios com S0 entre 61 e 144g/L, nos quais os maiores valores de YAgf/s , em tomo de 0,2 unidades de GFOR produzidas por grama de glicose consumida, foram encontrados.

s 0 (g/L)

FIGURA IV.13 - Fatores de conversão em atividade global nas células totais (YAüT/s ,0) e floculantes (YAgf/§ ,□) em função da concentração inicial de glicose (S0).

A Figura IV. 14 mostra as produtividades em atividade global de células totais (pAGT) e floculantes (pAGF), para cada concentração de S0 testada, constatando-se que o ensaio com S0=95g/L apresentou os maiores valores, pAGT=l,95U /(g.L) e

S0 (Q/L)

FIGURA IV.14 - Produtividades em atividade global de células totais (pAGX,0) e floculantes (pAGF, □) em função da concentração inicial de glicose (S0).

De acordo com os resultados, verificou-se que o ensaio 08, com 95g/L de substrato inicial, apresentou um bom índice de floculação e uma expressiva produtividade em etanol. Nesta condição, foram obtidos ainda valores relativamente altos de atividade específica, concentração de células floculantes, fator de conversão e produtividade em atividade global de células floculantes. Considerando estes aspectos, aliados ao fato de que nesta concentração de substrato não foi evidenciada inibição, as condições deste ensaio foram estabelecidas como básicas para a seqüência dos estudos descritos neste trabalho.

IV.2.2 Influência da agitação

O estudo da influência do estado de agitação do sistema sobre o crescimento celular de Zymomonas mobilis Z l-81, a floculação e a produção de glicose- frutose oxidorredutase (GFOR) e etanol foi realizado com concentração inicial de substrato em tomo de 100g/L e com a freqüência do agitador variando de 25 a 500min_1. Foram mantidos constantes o pH e a temperatura em 5,5 e 30°C, respectivamente. No ensaio a 25min_1, utilizou-se apenas a turbina superior do agitador e nos demais ensaios foram utilizadas três turbinas.

Na Tabela IV.4 são apresentados os resultados experimentais obtidos ao fim das fermentações e na Tabela IV.5 os índices de floculação, os fatores de conversão, rendimentos e produtividades obtidos nos ensaios.

TABELA IV.4 - Resultados experimentais obtidos ao fim dos ensaios para o estudo da influência da agitação.__________________________________________________________

Ensaio 17 08 15 14

Freqüência do agitador (min-1) 25 70 250 500

AS (g/L) 100,0 95,0 96,0 98,0 AP (g/L) 49,5 45,0 47,0 47,5 AXt (g/L) 1,92 2,49 3,08 3,38 AXl (g/L) 0,64 0,61 1,31 2,07 AXF (g/L) 1,28 1,88 1,77 1,30 A (U/g) 8,7 9,5 8,8 8,4 Agt (U/L) 17,4 24,4 28,0 29,2 Atii; (U/L) 11,7 18,5 16,4 11,6 t (h) 19,5 12,5 11,8 9,8

TABELA IV.5 - Resultados gerais dos ensaios realizados para o estudo da influência da agitação.________________________________________________________ Ensaio 17 08 15 14 iF (%) 67,0 75,9 58,5 39,6 R (%) 96,0 92,1 96,0 94,1 Yp/s 0,49 0,47 0,49 0,48 Y Xt/S 0,019 0,026 0,032 0,034 Y XiVS 0,0064 0,0064 0,014 0,021 Y Xf/S 0,013 0,020 0,018 0,013 Y A g t/S (U/g) 0,17 0,26 0,29 0,30 Ya g f/S (U/g) 0,12 0,20 0,17 0,12 P (g/(L.h)) 2,54 3,60 4,00 4,90 PAqt (U/(L.h)) 0,89 1,95 2,37 3,00 pAop (U/(L.h)) 0,60 1,48 1,39 1,18

A variação da concentração de células totais (AXT) é um dos pontos em que se verifica mais claramente a influência da agitação. De acordo com a Figura IV. 15, observa-se um aumento de ÀXT em função da freqüência do agitador. Observa-se, também, que quanto mais agitação se proporciona ao sistema, mais rapidamente a fermentação chega ao fim (Tabela IV.4). Este fato tem, provavelmente, relação com o desprendimento de C 0 2, formado durante a fermentação, pela agitação. Sendo o C 0 2 um inibidor do crescimento (VEERAMALLU e AGRAWAL, 1986), quanto maior a agitação mais facilmente o C 0 2 é retirado, promovendo maior concentração de células totais e, conseqüentemente, um menor tempo de fermentação. Outra possibilidade a cogitar, é que o aumento da agitação provoca a liberação de células e a redução do tamanho dos flocos, o que melhoraria o transporte de substrato e nutrientes para as células devido ao aumento da área de troca.

3

2

1

0

FIGURA IV. 15 - Concentrações de células totais (ÁXT, M ) e livres (AXL, ■ ) em função

da freqüência do agitador.

A Figura IV. 15 apresenta, ainda, a concentração de células livres (ÀXL) em função da freqüência do agitador. Foi observado um aumento de AXL a partir de 70min-], tendo o ensaio a 500min-1 apresentado uma concentração de células livres de aproximadamente 2g/L. Provavelmente, em agitações mais elevadas, as células desprenderam-se dos flocos por cisalhamento, aumentando assim a concentração de células livres no meio.

No ensaio a 25min-1 foi utilizada, apenas, a turbina superior do agitador, na tentativa de minimizar o desprendimento de células dos flocos em função do cisalhamento. Verificou-se, por meio de um traçador (corante fucsina), que estas condições proporcionavam uma agitação suficiente para manter a homogeneidade do líquido, necessária para o controle do pH e o acompanhamento do consumo de glicose e formação de etanol com o tempo. Era esperado, então, uma concentração menor de células livres, mas o que se observou foi uma concentração semelhante à concentração do ensaio a 70min-] com três turbinas, cerca de 0,6g/L.

A x t . A x l (g/L)

25 70 250 500

Por não se conhecer claramente o mecanismo de floculação destas células, torna-se difícil justificar este fato. O que foi observado neste ensaio, porém, é que durante a fermentação, os flocos sedimentaram, devido à baixa agitação, permanecendo em suspensão somente células livres. Supondo que as células livres não possuam a capacidade de se reagruparem para formar um novo floco, então, o fato de estarem em suspensão e, conseqüentemente, em maior contato com o substrato, pode ser usado para justificar o aumento da concentração de células livres. Esta teoria se apóia no trabalho de FEIN et al. (1983a) que demonstraram que, em um mesmo cultivo de Z. mobilis WR6, existem células com maior tendência a formar flocos enquanto outras se desenvolvem de forma individualizada.

A Figura IV. 16 apresenta a concentração de células floculantes (AXF) em função da freqüência do agitador. Verifica-se que o ensaio a TOmin-1 apresentou maior AXF, l,9g/L. Este resultado deve ser, provavelmente, função da ação conjunta de um baixo cisalhamento e uma remoção de C 0 2 mais eficiente.

F I G U R A IV .1 6 - C o n cen trações de célu las flocu lantes (A X F) em função da freqüência