Influência da quiralidade de teluranas na inibição da Catepsina B.

Atualmente, é reconhecida a importância da quiralidade no contexto da atividade biológica, já que, a nível molecular, a assimetria é fator dominante nos processos biológicos. Mesmo assim, a quiralidade não é pré-requisito de atividade biológica, mas nas moléculas bioativas que possuem um centro estereogênico, grandes diferenças de atividade são observadas entre os enantiômeros. Este fenômeno é geral e se aplica para todas as substâncias bioativas como fármacos, inseticidas, herbicidas, flavorizantes e fragrâncias e aditivos alimentares. Isto é de fato corroborado pelo fato de grande parte da composição molecular dos organismos vivos ser constituída de moléculas quirais. Por isso não causa surpresa que a quiralidade possua um importante papel nas interações envolvendo substâncias bioativas.77

A partir deste princípio geral, seria possível observar diferenças na potência inibitória

de Catepsina B para um par de teluranas enantioméricas? Para verificar esta hipótese, foram

utilizados métodos de biocatálise para permitir a preparação de teluranas quirais.

77 _{Sheldon, R. A. Chirality and Biological Activity. In Chirotechnology – Industrial Synthesis of Optically Active}

Compounds. Marcel Dekker: Nova Iorque, 1993, p. 39-72.

516

Ar (a)

-C₃H₇NO₂S -C7H7O

A rápida obtenção de (1R)-fenil-1-etanol e de seu enantiômero, em quantidades preparativas, com elevada pureza enantiomérica, permitiu a escolha de benzoxateluróis preparados de acordo com um trabalho de Minkin e colaboradores, que relataram a síntese racêmica de 2.46, a partir do telureto 2.47, preparado a partir de 1-fenil-1-etanol (Esquema 2.13).78 Esquema 2.13 OH Te Bu Cl2, CHCl3 OH Te BuCl Cl TEA, CH2Cl2 Te O Cl Bu 81% 2.47 2.46

O 1-fenil-1-etanol 2.48 foi obtido quantitativamente pela redução da acetofenona com NaBH4 em MeOH.79 A resolução cinética de (rac)-2.48 com a lipase de Candida antartica

(CAL-B) em hexano com acetato de vinila como grupo doador de acetato, resultou em (S)- 2.48 e no acetato (R)-2.49 que, após separação por cromatografia em coluna com sílica, foi quantitativamente hidrolisado ao correspondente álcool por K2CO3 em MeOH/H2O (Esquema

2.14). Esquema 2.14 OH CAL-B, n-Hexano acetato de vinila 7h, 32°C (rac)-2.48 OH OAc (S)-2.48 (R)-2.49 + >99% K_MeOH/H2CO3 2O OH (R)-2.48

Os álcoois (R)- e (S)-2.48 foram tratados com n-BuLi e TMEDA gerando os correspondentes diânions de lítio 2.50 por desprotonação e orto-metalação. O tratamento da mistura reacional com ditelureto de dibutila (2.51) permitiu a conversão dos aril-lítio nos teluretos (R)-2.52 e (S)-2.52 em rendimentos moderados (Esquema 2.15).

78 _{Sadekov, I. D.; Maksimenko, A. A.; Minkin, V. I. Tetrahedron 1996, 52, 3365.}

79 _{Tatchell, A. R. et al In Vogel´s Textbook of Practical Organic Chemistry , 5}ª _{ed., John Wiley & Sons: Nova}

Esquema 2.15 OH TeBu (S)-2.52 (56%) ou (R)-2.52 (58%) (S)-2.48 ou (R)-2.48

1. BuLi (2eq.), TMEDA pentano, refluxo, 12h (BuTe)2 2.51 3h OLi Li 2.50

Com a finalidade de comparação, o par de enantiômeros do correspondente seleneto foi preparado. Ao contrário do telureto, foi possível realizar a resolução cinética do seleneto racêmico 2.53 com CAL-B e acetato de vinila, gerando o álcool (S)-2.53 e o acetato (R)-2.54 (Esquema 2.16).

Esquema 2.16

(rac)-2.48 CAL-B, n-Hexano

acetato de vinila 7h, 32°C

OH OAc

(S)-2.53 (40%) (R)-2.54 (41%)

+

1. BuLi (2eq.), TMEDA pentano, refluxo, 12h 2. (BuSe)2, 3h

OH

SeBu SeBu SeBu

MeOH, KOH (10%) OH (R)-2.53 (94%) SeBu (rac)-2.53 (62%)

A configuração absoluta dos teluretos é a mesma dos álcoois utilizados em sua preparação. A configuração absoluta dos selenetos foi comprovada pela derivatização do seleneto obtido na forma de álcool na resolução cinética. O seleneto reagiu com n-BuLi em THF e após seu consumo quantitativo, o aril-lítio obtido foi hidrolisado com solução aquosa de NH4Cl. O álcool obtido foi analisado por cromatografia gasosa quiral e por polarimetria,

que coincidiram com o (1S)-fenil-1-etanol.

Os calcogenetos obtidos foram oxidados por reação com SO2Cl2. Normalmente o

tratamento de selenetos ou teluretos com SO2Cl2 resulta nos correspondentes dicloretos de

selênio ou de telúrio,80 mas esta reação resultou exclusivamente nos correspondentes oxacalcogenóis, formados pela ciclização do dicloreto ao oxacalcogenol (Esquema 2.17).

80 _{Irgolic, K. C. Organotellurium Compounds, Methods of Organic Chemistry (Houben-Weyl), Klaman, D. (ed.),}

Esquema 2.17 SO2Cl2, CH2Cl2 0°C, 30 min OH Y Bu OH Y Bu Cl Cl -HCl Y O Cl Bu

A obtenção direta dos oxateluróis (R)- e (S)-2.46 contrasta com o resultado obtido anteriormente por Sadekov e colaboradores.81 Naquele trabalho, a oxidação do mesmo telureto racêmico foi feita utilizando fluxo de Cl2 passando pela solução de (rac)-2.46 em

CCl4 a 0°C. Em seu trabalho, Sadekov apresentou análise elementar condizente com a

estrutura do dicloreto e a faixa de fusão de 92-94°C. O resultado obtido no presente trabalho apresentou faixas de fusão similares: para o isômero R de (95.3-95.4)°C e para o isômero S de (95.6-95.7)°C e análises elementares de acordo com a fórmula molecular dos oxateluróis (C12H17OTeCl).82 Ademais, o enantiômero R cristalizou como cristais incolores apropriados

para a determinação estrutural por difração de Raios-X (Figura 2.24).

Cl2 Te2 O2 C21 _C212 C27 C22 C26 C25 C28 C29 C210 C211 C24 C23

Figura 2.24. Projeção ORTEP da estrutura molecular de (R)-2.46.

A cela unitária de (R)-2.46 apresenta duas moléculas do oxatelurol, cada uma delas correspondente a um diasterisômero distinto (R, RTe) e (R, STe) (Figura 2.25). Nestes casos, o

telúrio também apresenta quiralidade,83 _{que foi gerada na ciclização do dicloreto; a presença}

81 _{Ref 79, p. 92.}

82 _{No trabalho de Sadekov, o suposto oxatelurol apresentou análise elementar condizente com C}

12H17OTeCl e a

faixa de fusão de 124-125°C.

83 _{As configurações relativas foram tentativamente atribuídas considerando a geometria de Ψ-TBP e elegendo as}

prioridades dos grupos de acordo com a regra CIP:

RO Te Cl Bu Ar Cl Te OR Bu Ar (1) (2) (3) (4) (1) (2) (3) (4) STe RTe

de diasterisômeros explica a presença de dois sinais no espectro de RMN de 125Te (Figura 2.26). Cl1 Te1 O1 C18 C19 C110 C111 C12 C11 C112 C17 C16 Cl2 Te2 O2 C21 C212 C27 C22 C26 C25 C28 C29 C210 C211

Figura 2.25. Projeção ORTEP dos diasterisômeros presentes na cela unitária de (R)-2.46.

Figura 2.26. Espectro de RMN de 125Te da mistura de diasterisômeros de (R)-2.46 em dmso-d6.

O espectro ilustrado acima foi adquirido de uma solução da mesma amostra que foi utilizada para a análise por difração de raios-X, indicando que os diasterisômeros se encontram na proporção de 1:1, mas o espectro quantitativo de 125Te, a 298K, indicou que a espécie com δ = 1191 ppm está em excesso de 18% em relação à espécie com δ = 1204 ppm. Os sinais correspondentes ao próton carbinólico ou as metilas, no espectro de RMN de 1H, apresentam o mesmo deslocamento químico, impossibilitando a comparação das integrações

dos espectros de 1H e de 125Te. O deslocamento químico deste oxatelurol mostrou um pronunciado efeito de solvente, pois em clorofórmio os diasterisômeros apresentaram δ = 847 e 801 ppm. Os deslocamentos químicos maiores em DMSO podem ser explicados pela coordenação do solvente com o telúrio,84 _{que resulta na desblindagem do telúrio.}

No espectro de RMN de 1H do oxaselenol (R)-2.55 os sinais correspondentes aos hidrogênios carbinólicos e aos hidrogênios metilênicos da butila de cada diasterisômero apresentaram uma separação adequada para a determinação do excesso diasteriomérico, que foi de 42% (Figura 2.27).

Figura 2.27. Ampliação do espectro de RMN de 1H de (R)-2.55 a 500 MHz em CDCl3.

Esta separação permitiu a realização do espectro de NOESY visando a determinação da estereoquímica relativa no selênio a partir das correlações entre os hidrogênios da metila ou carbinólicos com os hidrogênios metilênicos da butila (Figura 2.28).

Se O Cl H H H H3C (R, RSe) Se O Cl H H3C (R,SSe) H_H

Figura 2.28. Correlações esperadas no NOESY de (R)-2.55 para a determinação da estereoquímica relativa do

selênio.

84 _{A formação de complexos de teluranas e compostos coordenantes é conhecida. Veja por exemplo: (a)}

Srivastava, T. N.; Srivastava, R. C.; Singh, M. J. Organomet. Chem. 1978, 157, 405. (b) Bond, A. M.; Dakternieks, D.; Giacomo, R. D.; Hellenkamp, A. F. Organometallics 1991, 10, 3310.

Infelizmente, as correlações observadas no NOESY em fase positiva não possibilitaram a atribuição da estereoquímica, pois os hidrogênios carbinólicos de ambos os diasterisômeros se correlacionaram com os hidrogênios metilênicos da butila. Apesar disso, o NOESY em fase negativa apresentou correlações fora da diagonal para estes dois conjuntos de hidrogênios, indicando que estes núcleos estão envolvidos em um processo dinâmico conformacional ou de troca, que poderia ser a interconversão entre os diasterisômeros de 2.55 (Figura 2.29).85

Figura 2.29. Espectro de NOESY de uma solução 0.2M de (R)-2.55 em CDCl3

(500 MHz, “mixing time”:700 ms, 298K), a fase negativa está destacada em vermelho.

85 _{Nakanishi, K. One-Dimensional and Two-Dimensional NMR Spectra by Modern Pulse Techniques; John}

Para realizar os ensaios de inibição, foram feitas diversas tentativas de separação dos diasterisômeros (R) e (S)-2.46, utilizando SiO2 ou Al2O3 e diversos sistemas de solvente, mas

estas tentativas não tiveram êxito, observando a co-eluição dos diasterisômeros em todos os casos. Por isso, as misturas puras de diasterisômeros foram utilizadas nos ensaios de inibição da Catepsina B.

Ainda, para verificar a possibilidade de um equilíbrio em solução entre os diasterisômeros, foi realizada a aquisição de espectros quantitativos de RMN de 125Te em três temperaturas diferentes, 298K, 343K e 363K, os excessos diasterioméricos medidos foram respectivamente 18%, 17% e 15%. Esta variação discreta no e.d. com o aumento da temperatura pode indicar a ocorrência de um equilíbrio entre os diasterisômeros quando em solução. Neste provável equilíbrio só poderia ocorrer com a quebra da ligação Te-O, formando o intermediário 2.56 (Esquema 2.18).

Esquema 2.18 Te O Cl Bu O Te Cl Bu (R, STe) Te O Cl Bu (R, RTe) 2.56

A premissa original que motivou a preparação destes derivados de telúrio quirais foi confirmada porque os isômeros S mostraram atividade 10 vezes maior que os isômeros R. Em comparação com as teluranas testadas anteriormente, os oxateluróis apresentaram menor eficiência na inibição da Catepsina B, cujas constantes de inibição de segunda ordem, k2,

foram de 126 M-1s-1, para os isômeros S e 12 M-1s-1, para os isômeros R. Além disso, o mecanismo de inibição observado foi diferente daquele para a outra série de teluranas, apresentando cinética de saturação (Figura 2.30).

25 20 15 10 5 0 0,001 0,0008 0,0006 0,0004 0,0002 0 RT 13-S (uM) K o bs (s ) -1

A cinética de saturação é indicativa do estabelecimento de um pré-equilíbrio entre a enzima e o inibidor (Esquema 2.19), o que não foi observado na inibição da Catepsina B para as outras teluranas.

Esquema 2.19

Cat B + I Cat B I_A Cat B I_B Cat Binat

A interação de (R)-2.46 com cisteína foi monitorada por RMN de 125Te com a adição de 0,2, 0,5, 1 e 2 equivalentes de cisteína em relação a telurana. O consumo da telurana só foi total após a adição de 2 equivalentes de cisteína (Figura 2.31).

Figura 2.31. Acompanhamento da reação entre o benzoxatelurol 2.46 e cisteína em dmso-d6, a 27ºC. De baixo

para cima tem-se respectivamente os espectros do telurato (0,40M), da adição de 0,2, 0,5, 1 e 2 eq. de cisteína.

A interação de (R)-2.46 com cisteína resultou na formação de duas novas espécies em 840 e 335 ppm. A primeira espécie não exibiu mudanças com a adição progressiva de cisteína, mas próximo da segunda espécie, após duas horas da adição de 1 eq. de cisteína, surgiu uma nova espécie com δ = 344 ppm. Com a adição de 2 eq. de cisteína, a concentração desta nova espécie aumenta com um aparente consumo da espécie em 335 ppm (Figura 2.32).

Figura 2.32. Monitoramento da interação entre (R)-2.46 e cisteína na janela espectral de 550-50 ppm. De baixo

para cima estão os espectros com a adição progressiva de cisteína: 0,2 eq., 0,5 eq., 1 eq. (30 min.), 1 eq. (2h), 2 eq. (30 min.), 2 eq. (1h), 2 eq. (2h), 2 eq. (4h).

Com o intuito de verificar a identidade destas espécies, a interação de cisteína com uma amostra racêmica de 2.46 foi monitorada. A adição de 1 eq. de cisteína resultou na formação de duas espécies com δ = 839 e 336 ppm, com a adição de 2 eq. de cisteína, foi observado o aparecimento de duas espécies (δ = 840 e 839 ppm), enquanto que não foi observado a formação de uma segunda espécie na região de 350 ppm (Figura 2.33).

A variação do deslocamento químico entre 2.46 e as novas espécies (Δδ ≈ 360 ppm) indica a troca de substituintes eletronegativos ligados ao telúrio. Ainda, o resultado do experimento com (rac)-2.46 indica que a espécie em 839 ppm seria o produto da reação de substituição da cisteína porque a formação de duas espécies com deslocamentos químicos tão próximos é indicativo da formação de diasterisômeros.

Figura 2.33. Formação de diasterisômeros na interação entre cisteína e (rac)-2,46 em dmso-d6.

Uma nova verificação foi feita pela interação entre (R)-2.46 e um tiol racêmico, o (rac)-1-metil-1-propanotiol (2.57). À solução de (R)-2.46, foram adicionados 0,5, 1 e 2 eq. de 2.57 que resultou na formação de três espécies com δ = 688, 685 e 337 ppm (Figura 2.34). Novamente, a variação entre os deslocamentos químicos de 2.46 e dos adutos (Δδ ≈ 512 ppm) está de acordo com a troca de ligantes eletronegativos ligados ao telúrio. As espécies em 688 e 685 ppm seriam os diasterisômeros formados pela reação.

O consumo dos dois diasterisômeros do oxatelurol enantiomericamente enriquecido na reação com cisteína levou a formação de um único isômero, ao invés de dois [(R, RTe, RCys) e

(R, STe, RCys)], enquanto que a reação com o oxatelurol racêmico leva a formação de apenas

dois diasterisômeros, ao invés de quatro [(R, RTe, RCys), (R, STe, RCys), (S, RTe, RCys) e (S, STe,

RCys)]. Este resultado pode corroborar a proposição do equilíbrio em solução entre os

diasterisômeros (R, RTe) e (R, STe). Desta forma, o intermediário 2.56, reagiria com a cisteína

levando a formação preferencial de um único diasterisômero. Esta assertiva é corroborada pela utilização do tiol racêmico 2.57, que resultou na formação de dois diasterisômeros ao invés de quatro (Esquema 2.20).

Esquema 2.20 Te O Cl Bu O Te Cl Bu (R, STe) Te O Cl Bu (R, RTe) (R)-2.56 O Te S Bu (R, Rtiol) O Te Bu S (R, R_Cys) NH3Cl CO2H (R, ?Te, RCys) Te O Bu S CO2H H2N NH3Cl CO2H HS SH (rac)-2.57 O Te S Bu + _TeO Bu S Te O Bu S (R, Stiol) (R, ?Te, Rtiol) (R, ?Te, Stiol) L-cisteína

Apesar do interesse biológico em tiolatos de telúrio (RS)2Te e (RS)4Te, a busca de

precedentes sobre a reação entre teluranas e tióis, para comparação com os resultados obtidos, revelou o desconhecimento desta classe de compostos de telúrio. Apenas quinze tiolatos de telúrio(II) [(RS)2Te] são conhecidos. A única propriedade química conhecida é a labilidade

térmica e à luz que gera Te0 e os correspondentes dissulfetos.86 Por sua vez, os tiolatos de telúrio(IV), [(RS)4Te], são ainda menos conhecidos.87 Um método de preparação de (RS)4Te

a partir de TeCl4 e quantidades equimolares de tiol foi relatado,88 mas a reinvestigação desta

reação mostrou que o tetratiolato não pôde ser isolado pois se decompõe prontamente formado (RS)2Te e RSSR.87a Os derivados de ditiocarbamato são estáveis devido a

coordenação do telúrio a oito átomos de enxofre.89 Ditiolatos de diorganiltelúrio, [R2Te(SR’)2], preparados a partir de tióis arílicos ou alquílicos não são conhecidos a não ser

derivados de ditiocarbamatos, xantatos ou ditiofosfonatos.90 Estes precedentes indicam a necessidade da realização de mais estudos básicos sobre esta classe de compostos, para possibilitar a compreensão mais aprofundada da atividade biológica de teluranas.

86 _{(a) Stukalo, E. A.; Yur’eva, E. M.; Markovskii, L. N. Zh. Org. Khim. 1983, 19, 301. (b) Marurek, W.; Moritz,}

A. G.; O’Connor, J. Inorg. Chim. Acta 1986, 113, 143. (c) Fleischer, H.; Stauf, S.; Schollmeyer, D. Inorg. Chem.

1999, 38, 3725. (d) Fleischer, H.; Schollmeyer, D. Angew. Chem., Int. Ed. 2000, 39, 3705. (e) Fleischer, H.;

Schollmeyer, D. Inorg. Chem. 2002, 41, 4739.

87 _{(a) Golič, L.; Dietzch, W.; Köhler, K.; Stach, J.; Kirmse, R. J. Chem. Soc., Dalton Trans. 1988, 97. (b)}

Dietzsch, W.; Olk, R. –M.; Hoyer, E.; Meiler, W.; Robien, W. Magn. Reson. Chem. 1989, 27, 500.

88 _{Nakhdjavan, B.; Klar, G. Justus Liebigs Ann. Chem. 1977, 1683.}

89 _{Irgolic, K. C. Organotellurium Compounds, Methods of Organic Chemistry (Houben-Weyl), Klaman, D. (ed.),}

Vol. E12b, Georg Thieme Verlag: Stuttgart, 1990, p. 107-118.

4. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

Os resultados obtidos permitiram a demonstração de que teluranas orgânicas são inibidores muito mais efetivos de cisteíno-proteases do que teluranas sem nenhum grupo orgânico diretamente ligado ao telúrio, como é o caso do AS-101. Embora a triagem executada tenha sido aleatória, isto é, com a seleção de algumas classes de compostos disponíveis dos estudos de adição eletrofílica, os dados obtidos permitem a seleção de algumas classes como candidatas para futura otimização da atividade inibitória por modificações estruturais.

Dada a importância biológica da Catepsina B, a determinação de mais dados sobre a toxicidade de teluranas pode torná-las mais promissoras para futuros ensaios farmacológicos visando o estabelecimento destes compostos como agentes anti-metastáticos.

Os resultados obtidos com as teluranas quirais permitiram a demonstração da relevância da quiralidade na atividade biológica e ainda possibilitou a observação de mais aspectos sobre as propriedades químicas e estereoquímicas de reações de compostos de teluranas com tióis.

De modo geral, pode-se antecipar que qualquer telurana possa apresentar ação inibitória frente a cisteíno-proteases, mas um direcionamento criterioso para a investigação de novos derivados em futuras investigações deve ser considerado.