Influência de diferentes temperaturas de extração na reação de

Neste ensaio, realizado para o solvente KOH, foram fixados a concentração da base em 4% e o tempo de extração em uma hora. Variaram-se as temperaturas em temperatura ambiente (25 ºC), 50, 60 e 70 ºC.

Este ensaio não foi realizado com o solvente NH4OH, pela sua

volatilidade e pela dificuldade em se manter um sistema fechado a temperaturas mais elevadas utilizando este solvente.

A extração dos pigmentos das sementes e as retiradas das amostras de extratos nos tempos definidos foram executadas conforme descrito no item 2.2.1, e analisadas segundo os métodos de espectrofotometria UV/Visível e CLAE.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Influência do Tempo de Extração na Reação de Saponificação

As Figuras 1 e 2 mostram os cromatogramas obtidos pelas extrações com o KOH 0,1 N, à temperatura ambiente, nos tempos de 1, 2, 3, 4, 7 e 24 horas.

Observa-se, de acordo com os cromatogramas, que o pigmento majoritário encontrado nos extratos foi a bixina, correspondendo a acima de 91% da área total dos picos de cada cromatograma. A norbixina correspondeu apenas a cerca de 2% da área total dos picos, e sua formação não foi aumentada em tempos maiores de extração.

Portanto, de acordo com as Figuras 1 e 2, não ocorreu a reação de saponificação de forma significativa nas condições de extração com KOH 0,1 N, à temperatura ambiente, mesmo em grandes períodos de tempo, como 24 h de extração. Baseado nestas observações notou-se que, nas condições de extração avaliadas (KOH 0,1 N à temperatura ambiente), a reação de saponificação não foi dependente do tempo de extração.

Figura 1: Cromatogramas, obtidos por CLAE, dos extratos produzidos com KOH 0,1 N, à temperatura ambiente, de 1 a 4 horas de extração. Condições cromatográficas: coluna Lichrospher 100 RP-18 e acetonitrila:ácido acético 5% (75:25) como fase móvel com fluxo de 1 mL/min. Detecção a 460 nm.

1 h

2 h

3 h

Figura 2: Cromatogramas, obtidos por CLAE, dos extratos produzidos com KOH 0,1N, à temperatura ambiente, de 7 a 24 horas de extração. Condições cromatográficas: coluna Lichrospher 100 RP-18 e acetonitrila:ácido acético 5% (75:25) como fase móvel com fluxo de 1 mL/min. Detecção a 460 nm.

A Figura 3 apresenta os resultados da quantificação dos pigmentos de urucum, bixina e norbixina, por CLAE, obtidos pela extração com KOH 0,1 N, à temperatura ambiente, nos diferentes tempos avaliados. A Figura 4 apresenta os resultados da quantificação dos pigmentos de urucum, bixina e norbixina juntamente (bixinóides totais), por CLAE e por espectrofotometria, de forma comparativa, e apresenta a razão entre os valores obtidos em cada técnica analítica (Espectrofotometria/CLAE).

7 h

0 0,5 1 1,5 2 2,5 Tem po (h) T e o r d e p ig m en to ( g /100 g ) Bixina Norbixina B ixina 1,8 1,84 2,14 2,2 1,89 1,84 No rbixina 0,11 0,11 0,11 0,11 0,1 0,1 1 2 3 4 7 24

Figura 3: Teores de bixina e norbixina, obtidos por CLAE, para os extratos obtidos com KOH 0,1 N à temperatura ambiente, de 1 a 24 h de extração.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 Tempo (h) Te o r de pigme n to ( g /1 0 0 g)

CLAE Espectrofotometria Espectro/CLAE

CLAE 1,91 1,95 2,25 2,31 1,99 1,94

Espectrofotometria 2,04 1,74 1,75 1,95 2,01 1,75

Espectro/CLAE 1,07 0,89 0,78 0,84 1,01 0,9

1 2 3 4 7 24

Figura 4: Bixinóides totais, obtidos por CLAE e por espectrofotometria, para os extratos obtidos com KOH 0,1 N à temperatura ambiente, de 1 a 24 h de extração, e razão Espectro/CLAE.

De acordo com as Figuras 3 e 4, não foi observado aumento no teor de bixinóides totais extraídos com o aumento no tempo de extração. Notou- se, mais claramente na quantificação por CLAE, que o teor de bixinóides totais permaneceu praticamente constante durante todo o tempo de extração (1,91% em uma hora de extração e 1,94% em 24 horas de extração – Figura 4).

Estabeleceu-se a razão entre os teores de bixinóides totais obtidos por espectrofotometria e por CLAE (Figura 4) para que se verificasse a validade de ambas as metodologias na quantificação dos pigmentos. Uma relação constante de Espectro/CLAE ao longo de um mesmo ensaio significa uma convergência entre ambos os métodos na determinação dos pigmentos, e que, salvos alguns desvios, indica segurança dos métodos.

Quando se estabelecem comparações entre métodos de quantificação de pigmentos por CLAE e por espectrofotometria, normalmente são encontrados desvios entre os métodos (RODRIGUEZ- AMAYA, 1988; ALVES et al., 2006). A espectrofotometria, numa dada região do espectro visível (neste trabalho, de 400 nm a 550 nm), irá quantificar todos os compostos que apresentam alguma absorção nesta região, apesar de que, quando se utilizam o comprimento de onda de máxima absorção e o coeficiente de absortividade relativo a este comprimento de onda, a absorção nos outros comprimentos de onda é minimizada. Apesar disso, por espectrofotometria, são quantificados outros pigmentos que não a bixina e a norbixina. A bixina e a norbixina, por espectrofotometria, são quantificadas juntas, e o resultado pode ser expresso em percentual de pigmentos totais, já que, mesmo utilizando métodos direcionados para uma ou para a outra, seus comprimentos de onda de máxima absorção são próximos. Neste trabalho, o comprimento de onda escolhido para se realizarem os cálculos foram 505 nm, nas amostras onde havia predominância de bixina, e 503 nm, para as amostras onde a norbixina predominava. De acordo com RODRIGUEZ-AMAYA (1988) e LEVY e RIVADENEIRA (2000), nestes comprimentos de onda há menos interferência da possível presença de produtos de decomposição amarelos, que ficariam sobrepostos na curva espectral. Já a técnica de CLAE, como quantifica separadamente os pigmentos de urucum bixina e norbixina, nos fornece mais informações

acerca do que foi extraído e do teor de outros carotenóides possivelmente interferentes no extrato, que poderiam ter sido quantificados pela espectrofotometria.

Dados os desvios entre as técnicas de CLAE e espectrofotometria, é comum se encontrarem resultados mais elevados do teor de pigmentos quando se usa a espectrofotometria, comparado ao teor encontrado quando se usa a CLAE. Entretanto, neste ensaio, na maioria dos tempos de extração avaliados (2, 3, 4 e 24 h), os resultados obtidos pela CLAE foram superiores àqueles obtidos por espectrofotometria (Figura 4). Possivelmente houve degradação dos pigmentos nos frascos destinados à análise por espectrofotometria, já que, neste ensaio, os extratos, antes de serem diluídos no solvente adequado de leitura espectrofotométrica (solução de 3,7% de ácido acético em clorofórmio), foram diluídos em uma solução de tetrahidrofurano:acetonitrila:água (1:1:2) e armazenados. Suspeitou-se que esta solução poderia ter causado a oxidação e a conseqüente degradação dos pigmentos, o que explicaria os baixos valores encontrados para o método espectrofotométrico.

A Figura 5 mostra os cromatogramas obtidos pelas extrações com o NH4OH 0,5 N, à temperatura ambiente, nos tempos de 30 minutos, 3, 5 e 24

horas.

Observou-se, de acordo com os cromatogramas, que o pigmento majoritário encontrado nos extratos foi a bixina, durante o tempo avaliado. Para o tempo inicial de extração (30 minutos), a bixina correspondeu a aproximadamente 91% da área total dos picos, enquanto a norbixina correspondeu a cerca de 2% apenas. Neste tempo, a soma das áreas da bixina e da norbixina correspondeu a 93% do total. De acordo com o andamento da reação, já a 3 horas de extração, observou-se ligeiro aumento na conversão da bixina a norbixina. Aqui, a bixina correspondeu a aproximadamente 87% da área total dos picos, enquanto a norbixina cresceu para aproximadamente 6%, e a soma de seus percentuais ainda atingia 93% do total. Quando o tempo de extração atingiu 5 horas, notou-se que a reação de saponificação prosseguia, com a norbixina correspondendo a cerca de 9% dos pigmentos totais, enquanto a bixina decrescia a 84%. Neste tempo de extração, a soma das áreas da bixina e da norbixina ainda

equivalia a 93%. Ao fim de 24 horas de extração, observou-se que a reação ainda ocorria, e a norbixina correspondia a 21% dos pigmentos totais, enquanto a bixina representava aproximadamente 57% dos pigmentos. Entretanto, neste tempo de extração, a soma dos percentuais de bixina e de norbixina foi de apenas 78% do total e, de acordo com a Figura 5, notou-se o surgimento de novos picos no cromatograma, que antes não estavam presentes ou estavam presentes em quantidades muito pequenas. Estes picos poderiam representar compostos oriundos da degradação dos pigmentos bixina e norbixina em compostos de menor peso molecular, ou mesmo da isomerização destes pigmentos. Estas reações de degradação ou de isomerização poderiam, possivelmente, ser ocasionadas pelo longo tempo de extração, em que os pigmentos de urucum ficariam em contato com uma condição de pH elevado por longo tempo, causando esta modificação do perfil dos extratos.

SCOTTER et al. (1998) observaram que a presença de produtos de degradação poderia ser indicativa do uso elevadas temperaturas de extração, mas ressaltam que a bixina poderia também ser submetida à degradação fotocatalisada, e originar compostos similares àqueles oriundos da degradação térmica. É possível que tal processo possa ocorrer durante a extração com solvente da bixina, antes da hidrólise à norbixina.

Portanto, de acordo com a Figura 5, a reação de saponificação da bixina em sal de norbixina ocorreu parcialmente, até o último tempo avaliado. Notou-se que esta reação, nas condições avaliadas, acontecia lentamente, já que o tempo de extração foi elevado (24 h). Com isso, observou-se certa influência do tempo na saponificação da bixina a norbixina durante a extração utilizando NH4OH 0,5 N, à temperatura ambiente.

Comparado ao solvente KOH 0,1 N, o solvente NH4OH 0,5 N, à

temperatura ambiente e até 24 horas de extração, possibilitou a saponificação da bixina a norbixina de maneira mais eficiente. Ainda, o extrato obtido pelo solvente NH4OH 0,5 N foi o que apresentou mais

alterações em um longo tempo de extração, comparado ao extrato obtido com o KOH 0,1 N, o que poderia ser uma característica indesejável. Notou- se, aqui, que a possível isomerização dos pigmentos de urucum, no extrato obtido por NH4OH 0,5 N, seria proporcional ao tempo de extração.

Figura 5: Cromatogramas, obtidos por CLAE, dos extratos produzidos com NH4OH 0,5 N, à temperatura ambiente, de 30 minutos a 24 horas de

extração. Condições cromatográficas: coluna Lichrospher 100 RP-18 e acetonitrila:ácido acético 5% (75:25) como fase móvel com fluxo de 1 mL/min. Detecção a 460 nm.

3 h

5 h

24 h 30 min

A Figura 6 apresenta os resultados da quantificação dos pigmentos de urucum, bixina e norbixina, obtidos pela extração com NH4OH 0,5 N, à

temperatura ambiente, nos diferentes tempos avaliados. A Figura 7 apresenta os resultados da quantificação dos pigmentos de urucum, bixina e norbixina juntamente (bixinóides totais), por CLAE e por espectrofotometria, de forma comparativa, e apresenta a razão entre os valores obtidos em cada técnica analítica (Espectrofotometria/CLAE).

0 0,5 1 1,5 2 2,5 Tempo (h) Teor de pi gmento (g/ 100 g) Bixina Norbixina Bixina 1,69 1,65 1,99 1,11 Norbixina 0,12 0,19 0,29 0,51 0,5 3 5 24

Figura 6: Teores de bixina e norbixina, obtidos por CLAE, para os extratos obtidos com NH4OH 0,5 N à temperatura ambiente, de 30 minutos a 24 h de

0 0,5 1 1,5 2 2,5 Tempo (h) Teor de pigme n to (g/100 g)

CLAE Espectrofotometria Espectro/CLAE

CLAE 1,81 1,83 2,27 1,62

Espectrofotometria 1,80 1,93 1,45 2,10

Espectro/CLAE 1,00 1,06 0,64 1,30

0,5 3 5 24

Figura 7: Bixinóides totais, obtidos por CLAE e por espectrofotometria, para os extratos obtidos com NH4OH 0,5 N à temperatura ambiente, de 30

minutos a 24 h de extração, e razão Espectro/CLAE.

De acordo com as Figuras 6 e 7, pela quantificação por CLAE, ao tempo de 24 horas de extração, os teores de bixinóides totais diminuíram sensivelmente, quando comparados aos outros tempos de extração. Este fato encontra-se em concordância com a diminuição da soma das áreas dos picos da bixina e da norbixina, que neste tempo caiu para de 93% para 78%. Entretanto, por espectrofotometria, no tempo de 24 horas, não foi observada a diminuição do teor de bixinóides totais, o que pode ser explicado pela formação dos compostos resultantes da isomerização ou de uma possível degradação (Figura 7). Estes novos compostos também foram quantificados pela espectrofotometria. Com isso, em face deste desvio na quantificação entre os dois métodos, neste trabalho recomenda-se a utilização do método de CLAE para a quantificação de pigmentos de urucum, já que com a CLAE são quantificados apenas os compostos de interesse, a bixina e a norbixina, e não outros pigmentos, como observado no método espectrofotométrico.

Aqui, assim como quando se utilizou o solvente KOH 0,1 N, possivelmente houve degradação dos pigmentos nos frascos destinados à análise por espectrofotometria, já que, neste ensaio, os extratos, antes de serem diluídos no solvente adequado de leitura espectrofotométrica (solução de 3,7% de ácido acético em clorofórmio), também foram diluídos em uma solução de tetrahidrofurano:acetonitrila:água (1:1:2) e armazenados. Suspeitou-se que esta solução poderia ter causado a oxidação e a conseqüente degradação dos pigmentos, o que explicaria os baixos valores encontrados para o método espectrofotométrico.

SCOTTER et al. (1998), ao avaliar comparativamente teores de bixina e norbixina de corantes de urucum em pó por espectrofotometria e por CLAE, encontraram concordância entre os métodos em relação ao percentual de pigmentos encontrados. Segundo os autores, esta concordância entre os métodos indicaria que a contribuição de compostos de degradação térmica da bixina (C17) e de outros carotenóides no teor de

pigmentos totais presentes seria negligenciável.

3.2. Influência do Tempo de Extração e da Concentração dos Solventes na Reação de Saponificação

As Figuras 8, 9 e 10 mostram os cromatogramas obtidos pelas extrações com o KOH a 50 ºC, nas concentrações de 1, 2, 3, 4 e 5%, durante uma e duas horas de extração.

Observou-se, de acordo com os cromatogramas da Figura 8, que o pigmento majoritário oriundo da extração com o KOH a 1%, pelos tempos de uma e duas horas de extração, foi a bixina. Ao tempo de uma hora de extração a bixina correspondeu a 79% da área total dos picos presentes, enquanto a norbixina correspondeu a aproximadamente 12%. A duas horas de extração, a condição não se alterou, sendo que a bixina correspondia a 82% da área total dos picos e a norbixina a 10%. Portanto, nesta condição extratora (KOH 1% a 50 ºC), houve uma saponificação parcial da bixina para formar a norbixina, que não se alterou com o tempo.

Quando se elevou a concentração do KOH para 2% (Figura 8), a uma hora de extração notou-se que, apesar do pigmento majoritário ainda

ser a bixina, notou-se maior teor de norbixina formada. Aqui a bixina correspondeu a 62% dos pigmentos formados, enquanto a norbixina a cerca de 30%. A duas horas de extração, houve alteração do extrato, direcionada à maior formação de norbixina. Aqui a norbixina correspondeu a 37% dos pigmentos totais, enquanto a bixina correspondeu a 55%. Portanto, nesta condição extratora (KOH 2% a 50 ºC), houve saponificação da bixina a norbixina de forma mais acelerada, quando se comparou à extração com KOH a 1%. Entretanto, quando se compararam os dois tempos de extração, notou-se pouca evolução na reação de saponificação.

Em relação à extração com o KOH 3% (Figura 9), ao tempo de uma hora, observou-se que a norbixina foi o pigmento majoritário encontrado no extrato, correspondendo a 51% dos pigmentos totais. Já a bixina correspondeu a 42%. A duas horas de extração, houve grande alteração no perfil do extrato, com a norbixina representando aproximadamente 85% dos pigmentos totais e a bixina representando apenas 6% dos pigmentos. Portanto, nesta condição extratora (KOH 3% a 50 ºC), houve saponificação da bixina a norbixina quase totalmente, e notou-se grande dependência do tempo de extração na formação da norbixina.

Na extração com o KOH 4% (Figura 9), ao tempo de uma hora, observou-se que o principal pigmento extraído foi a norbixina, representando 74% da área total dos picos, enquanto a bixina respondia por apenas 18%. A duas horas de extração, notou-se que a reação de saponificação continuava ocorrendo, com a norbixina representando 84% dos pigmentos totais e a bixina cerca de 9%. Com isso, nesta condição extratora (KOH 4% a 50 ºC), houve saponificação da bixina a norbixina, moderadamente intensificada pelo tempo.

Utilizando-se o KOH 5% (Figura 10), durante uma hora de extração, a norbixina extraída correspondeu a 69% dos pigmentos totais, enquanto a bixina correspondeu a 23%. Já a duas horas de extração, a norbixina correspondeu a 88% dos pigmentos totais, enquanto a norbixina respondeu apenas por 4% dos pigmentos. Notou-se que a reação de saponificação estava ocorrendo de forma eficiente e, assim como para o KOH 4%, foi moderadamente intensificada pelo tempo.

Figura 8: Cromatogramas, obtidos por CLAE, dos extratos produzidos com KOH a 1% e 2%, a 50 ºC, durante uma e duas horas de extração. Condições cromatográficas: coluna Lichrospher 100 RP-18 e acetonitrila:ácido acético 5% (75:25) como fase móvel com fluxo de 1 mL/min. Detecção a 460 nm.

KOH 1%/1h

KOH 1%/2h

KOH 2%/1h

Figura 9: Cromatogramas, obtidos por CLAE, dos extratos produzidos com KOH a 3% e 4%, a 50 ºC, durante uma e duas horas de extração. Condições cromatográficas: coluna Lichrospher 100 RP-18 e acetonitrila:ácido acético 5% (75:25) como fase móvel com fluxo de 1 mL/min. Detecção a 460 nm.

KOH 3%/1h

KOH 3%/2h

KOH 4%/1h

Figura 10: Cromatogramas, obtidos por CLAE, dos extratos produzidos com KOH a 5%, a 50 ºC, durante uma e duas horas de extração. Condições cromatográficas: coluna Lichrospher 100 RP-18 e acetonitrila:ácido acético 5% (75:25) como fase móvel com fluxo de 1 mL/min. Detecção a 460 nm.

Analisando-se as Figuras 8, 9 e 10, observou-se que a reação de saponificação da bixina a norbixina tem sua velocidade aumentada com o aumento da concentração de KOH, na faixa de concentrações avaliadas. Observou-se, também, a influência do tempo na conversão da bixina a norbixina, de forma mais evidente para as concentrações de KOH de 3% a 5%.

PRENTICE-HERNANDEZ et al. (1992), ao avaliar o percentual de bixina e norbixina produzidas na extração com NaOH variando de 0,2 a 0,6%, durante duas horas, encontraram que para as soluções de NaOH 0,2 e 0,3% não houve formação de norbixina, mas somente de bixina. A partir das soluções de NaOH de 0,4 a 0,6%, os autores observaram a saponificação do grupo éster, formando a norbixina dentro de uma reação considerada irreversível. Estes resultados concordam com os resultados obtidos até aqui, de que a reação de hidrólise do grupamento éster da bixina é dependente da concentração da base. Entretanto, quando se utilizou KOH

KOH 5%/1h

0,1 N (que corresponde a 0,6%), no item 3.1. deste trabalho, não foi observada formação de norbixina, mesmo em 24 horas de extração. PRENTICE-HERNANDEZ et al. (1992), ao se utilizar a base NaOH 0,6%, já observaram a formação de norbixina. Com isso, observa-se que o tipo de base deveria influenciar na reação de saponificação.

A Figura 11 apresenta os resultados da quantificação dos pigmentos de urucum, bixina e norbixina, obtidos pela extração com KOH a diferentes concentrações, a 50 ºC, variando-se o tempo de extração. A Figura 12 apresenta os resultados da quantificação dos pigmentos de urucum, bixina e norbixina juntamente (bixinóides totais), por CLAE e por espectrofotometria, de forma comparativa, e apresenta a razão entre os valores obtidos em cada técnica analítica (Espectrofotometria/CLAE).

1% 1 h 1% 2 h 2% 1 h 2% 2 h 3% 1 h 3% 2 h 4% 1 h 4% 2 h 5% 1 h 5% 2 h 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00 Te or de p igm e n to s (g/10 0 g)

KOH - Condição extratora

Bixina Norbixina

Bixina 1,98 1,80 1,22 1,15 0,94 0,13 0,36 0,19 0,44 0,09

Norbixina 0,40 0,31 0,70 0,89 1,26 1,76 1,59 1,76 1,43 1,83 1% 1h 1% 2h 2% 1h 2% 2h 3% 1h 3% 2h 4% 1h 4% 2h 5% 1h 5% 2h

Figura 11: Teores de bixina e norbixina, obtidos por CLAE, para os extratos obtidos com KOH a 50 ºC, nas concentrações de 1 a 5%, durante 1 e 2 h de extração.

1% 1 h 1% 2 h 2% 1 h 2% 2 h 3% 1 h 3% 2 h 4% 1 h 4% 2 h 5% 1 h 5% 2 h 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 T eo r d e p ig m en to ( g /100 g )

KOH - Condição extratora

Espectro/CLAE CLAE Espectrofotometria

Espectro/CLAE 1,09 1,13 1,36 1,37 1,34 1,52 1,54 1,33 1,48 1,33

CLAE 2,38 2,10 1,92 2,04 2,19 1,89 1,95 1,95 1,87 1,92

Espectrofotometria 2,60 2,38 2,61 2,80 2,93 2,88 3,00 2,59 2,76 2,56 1% 1h 1% 2h 2% 1h 2% 2h 3% 1h 3% 2h 4% 1h 4% 2h 5% 1h 5% 2h

Figura 12: Bixinóides totais, obtidos por CLAE e por espectrofotometria, para os extratos obtidos com KOH a 50 ºC, nas concentrações de 1 a 5%, durante 1 e 2 h de extração, e razão Espectro/CLAE.

De acordo com as Figuras 11 e 12, não houve aumento nos teores de pigmentos extraídos quando se aumentou o tempo de extração de uma para duas horas. Ainda, pelas duas técnicas analisadas (CLAE e espectrofotometria) observou-se que o aumento na concentração do álcali não proporcionou um aumento no teor de pigmentos extraídos.

Os teores de bixinóides totais obtidos por espectrofotometria foram superiores àqueles obtidos por CLAE (Figura 12). Isso foi esperado de ocorrer, pois, conforme já discutido no item 3.1., a espectrofotometria quantifica pigmentos totais que absorvem na região analisada.

A relação espectro/CLAE foi calculada para se verificar a convergência entre os métodos CLAE e espectrofotometria na quantificação

dos bixinóides totais. Notou-se, para cada condição extratora nos dois tempos avaliados (por exemplo, KOH 1%, 1 e 2h – Figura 12), que as relações foram bem próximas, indicando a validade de ambos os métodos, apesar das diferenças encontradas quando se analisam ambos de forma comparativa.

As Figuras 13, 14 e 15 mostram os cromatogramas obtidos pelas extrações com o NH4OH à temperatura ambiente, nas concentrações de 1,

2, 3, 4 e 5%, durante uma e duas horas de extração.

De acordo com as Figuras 13, 14 e 15, ao se utilizar o solvente alcalino NH4OH a diferentes concentrações, à temperatura ambiente e em

tempos variando de uma a duas horas de extração, não ocorreu a reação de saponificação da bixina para a formação do sal da norbixina de forma apreciável. Notou-se que, tanto em uma hora de extração quanto em duas horas, para quaisquer das concentrações avaliadas, o pigmento majoritário extraído foi a bixina, correspondendo entre 87 e 90% dos pigmentos totais. A norbixina correspondeu de 2 a 5% dos pigmentos totais apenas. Com isso, verificou-se que a reação de saponificação não foi dependente da concentração quando se utilizou o solvente NH4OH nas concentrações

avaliadas. Ainda, o tempo de duas horas não foi suficiente para a formação da norbixina.

PRENTICE-HERNANDEZ et al. (1992) observaram que, quando se utilizavam soluções de concentrações crescentes (e crescentes pH), além da crescente diminuição da concentração de bixina e aumento na concentração de norbixina, houve progressivo aumento na concentração de trans-bixina. Essa isomerização não foi observada neste trabalho quando se aumentou a concentração das bases KOH e NH4OH.

Figura 13: Cromatogramas, obtidos por CLAE, dos extratos produzidos com NH4OH a 1% e 2%, à temperatura ambiente, durante uma e duas horas de

extração. Condições cromatográficas: coluna Lichrospher 100 RP-18 e acetonitrila:ácido acético 5% (75:25) como fase móvel com fluxo de 1 mL/min. Detecção a 460 nm. NH4OH 1%, 1h NH4OH 1%, 2h NH4OH 2%, 1h NH4OH 2%, 2h

Figura 14: Cromatogramas, obtidos por CLAE, dos extratos produzidos com NH4OH a 3% e 4%, à temperatura ambiente, durante uma e duas horas de

extração. Condições cromatográficas: coluna Lichrospher 100 RP-18 e acetonitrila:ácido acético 5% (75:25) como fase móvel com fluxo de 1