INIBIÇÃO DA TROMBINA (IIa) PELO COFATOR II DA HEPARINA OU

A atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados é devido ao aumento da inibição de proteases mediada por cofatores plasmáticos específicos, pincipalmente antitrombina e cofator II da heparina (BÉGUN, LINDHOUT e HEMKER, 1988).

A capacidade da -G-S2 em inibir a trombina através do cofator II da heparina ou

antitrombina foi determinada através de ensaios de atividade amidolítica como descrito nos itens 3.7.4.1 e 3.7.4.2. Os resultados obtidos estão demonstrados nas Figura 24 e

Tabela 15, onde é possível observar que a -G-S2 na presença de antitrombinainibiu a

trombina completamente em baixas concentrações (0,125-2 g/ml). Na concentração de 4 g/ml a inibição da trombina foi de 99,7% (Tabela 15 e Figura 24). A -G-S2

também inibiu a trombina na presença do cofator II da heparina, entretanto, a porcentagem de inibição foi menor quando comparado com o ensaio realizado na presença de AT (Tabela 15).

A trombina foi diretamente inibida na presença de -G-S2 e ausência de ambos

os inibidores, antitrombina e cofator II da heparina (Tabela 16 e Figura 25). Pequenas quantidades do polissacarídeo, até 0,5 g/ml inibem parcialmente a atividade da trombina, concentrações maiores aumentam progressivamente a inibição direta da trombina até sua total inibição em 2 g/ml. Estes resultados indicam que a -G-S2 é um

inibidor direto da trombina, e que seu efeito é potencializado principalmente pela antitrombina.

Para a maioria dos polissacarídeos sulfatados, ainda não é conhecida uma seqüência específica para a interação de polissacarídeos sulfatados com cofatores no plasma ou proteases alvo (YOON, et al., 2002). Acredita-se que a ação anticoagulante de polissacarídeos sulfatados resulta da forte interação entre cargas negativas de grupos sulfato com as cargas positivas de seqüências peptídicas de proteínas reguladoras da coagulação (HUANG et al., 2003), sendo que, a posição em que os grupos sulfatos encontram-se na molécula é importante.

A maioria dos polissacarídeos sulfatados é capaz de inibir a trombina através da antitrombina, ou do cofator II da heparina ou ambos. Alguns polissacarídeos sulfatados são capazes de inibir diretamente a trombina independente da antitrombina ou cofator II da heparina. Uma heparina extraída de Penaeus brasiliensis apresenta atividade anticoagulante exercida principalmente pela inibição do fator Xa e inibição da trombina através do cofator II da heparina (DIETRICH et al., 1999), um oligossacarídeo denominado fosfomanopentose sulfato (PI-88), atua como anticoagulante por aumentar a habilidade do cofator II da heparina em inibir a trombina não atuando sobre a AT (WALL et al., 2001), outro polissacarídeo sulfatado, uma D-galactana obtida da alga Botryocladia occidentalis exerce atividade anticoagulante devido ao aumento na

inibição da trombina e fator Xa pela antitrombina e cofator II da heparina (FARIAS et al., 2000). Um dermatan sulfato proveniente de Styela plicata inibe a trombina exclusivamente através da inibição da trombina mediada pelo cofator II da heparina (PAVÃO et al., 1998) enquanto que uma fucana sulfatada extraída de L. brasiliensis é capaz de inibir diretamente a trombina (PEREIRA et al., 1999). Além destes, diversos outros polissacarídeos sulfatados apresentam o mecanismo de ação elucidado.

TABELA 15 - EFEITO DA -G-S2 NA INIBIÇÃO DA TROMBINA PELA ANTITROMBINA E COFATOR II

DA HEPARINA -G-S2 COFATOR II DA HEPARINA (HCII) ANTITROMBINA (AT) Concentração g/ml % DE ATIVIDADE DA TROMBINA % DE INIBIÇÃO DA TROMBINA % DE ATIVIDADE DA TROMBINA % DE INIBIÇÃO DA TROMBINA 0,125 39,6 60,4 2,3 97,7 0,25 46,7 53,3 1,5 98,5 0,5 51,7 48,3 2,1 97,9 1 50,4 49,6 5,2 94,8 2 0,8 99,2 1,5 98,5 4 0 100 0,3 99,7

Diferentes concentrações da -G-S2, foram incubadas em micro-cubetas por 60 segundos a 37ºC com 10 l de trombina (20 nM), 25 l de cofator II da heparina (120nM) ou antitrombina (40nM) e tampão TS/PEG (Tris/HCl 0,02M, NaCl 0,15 M e polietileno glicol 1,0 mg/ml, pH 7,4). Após o período de incubação, 25 l do substrato cromogênico S-2238 (Chromogenix AB) em tampão TS/PEG foi adicionado e a absorbância foi medida em 405nm em espectrofotômetro por 5 minutos. A taxa de variação na absorbância, expressa como ∆A405/min, foi proporcional a atividade remanescente da trombina no meio reacional. Experimentos controle foram realizados como descrito acima, porém, na ausência do polissacarídeo sulfatado. Para cada dose testada, foram feitas três determinações e calculada a % de atividade e de inibição da trombina.

0 20 40 60 80 100 120 0,1 1 10 Concentração (ug/ml) Inibição da trombina (%)

FIGURA 24 - EFEITO DA -G-S2 NA INIBIÇÃO DA TROMBINA PELA ANTITROMBINA E COFATOR II

DA HEPARINA

Diferentes concentrações da -G-S2, foram incubadas em micro-cubetas por 60 segundos a 37ºC com 10 l de trombina (20 nM), 25 l de cofator II da heparina (120nM) ou antitrombina (40nM) e tampão TS/PEG (Tris/HCl 0.02M, NaCl 0,15 M e polietileno glicol 1,0 mg/ml, pH 7,4). Após o período de incubação, 25 l do substrato cromogênico S-2238 (Chromogenix AB) em tampão TS/PEG foi adicionado e a absorbância foi medida em 405nm em espectrofotômetro por 5 minutos. A taxa de variação na absorbância, expressa como ∆A405/min, foi proporcional a atividade remanescente da trombina no meio reacional. Experimentos controle foram realizados como descrito acima, porém, na ausência do polissacarídeo sulfatado. Para cada dose testada, foram feitas três determinações e calculada a % de atividade e de inibição da trombina. Experimento realizado na presença de AT (quadrados abertos) e na presença de HC II (triângulos fechados).

TABELA 16 - EFEITO DA -G-S2 NA INIBIÇÃO DA TROMBINA NA AUSÊNCIA DOS INIBIDORES

ANTITROMBINA E COFATOR II DA HEPARINA

-G-S2 Concentração g/ml % DE ATIVIDADE DA TROMBINA % DE INIBIÇÃO DA TROMBINA 0,032 78,2 21,8 0,0625 72,5 27,5 0,125 71,0 29,0 0,25 69,0 31,0 0,5 65,6 34,4 1 47,8 52,2 2 6 94

Diferentes concentrações da -glucana (16)-SO4, foram incubadas em micro-cubetas por 60 segundos

a 37ºC com 10 l de trombina (20 nM) e tampão TS/PEG (Tris/HCl 0.02M, NaCl 0,15 M e polietileno glicol 1,0 mg/ml, pH 7,4) na ausência dos inibidores cofator II da heparina e antitrombina. Após o período de incubação, 25 l do substrato cromogênico S-2238 (Chromogenix AB) em tampão TS/PEG foi adicionado e a absorbância foi medida em 405nm em espectrofotômetro por 5 minutos. A taxa de variação na absorbância, expressa como ∆A405/min, foi proporcional a atividade remanescente da trombina no meio reacional. Experimentos controle foram realizados como descrito acima, porém, na ausência do polissacarídeo sulfatado. Para cada dose testada, foram feitas três determinações e calculada a % de atividade e de inibição da trombina.

0

30

60

90

120

0,1

1

10

Concentração (ug/ml)

Inibição trombina (%)

FIGURA 25 - EFEITO DA -G-S2 NA INIBIÇÃO DA TROMBINA NA AUSÊNCIA DOS INIBIDORES

ANTITROMBINA E COFATOR II DA HEPARINA

Diferentes concentrações da -glucana (16)-SO4, foram incubadas em micro-cubetas por 60 segundos

a 37ºC com 10 l de trombina (20 nM) e tampão TS/PEG (Tris/HCl 0.02M, NaCl 0,15 M e polietileno glicol 1,0 mg/ml, pH 7,4) na ausência dos inibidores cofator II da heparina e antitrombina. Após o período de incubação, 25 l do substrato cromogênico S-2238 (Chromogenix AB) em tampão TS/PEG foi adicionado e a absorbância foi medida em 405nm em espectrofotômetro por 5 minutos. A taxa de variação na absorbância, expressa como ∆A405/min, foi proporcional a atividade remanescente da trombina no meio reacional. Experimentos controle foram realizados como descrito acima, porém, na ausência do polissacarídeo sulfatado. Para cada dose testada, foram feitas três determinações e calculada a % de atividade e de inibição da trombina.

4.2 GALACTOGLUCOMANANA SULFATADA DO LÍQUEN Cladonia ibitipocae (GGM-