5. MATERIAIS E MÉTODOS
6.2. Inibição dos efeitos biológicos do veneno total de Bothrops
A atividade antimiotóxica dos compostos 1-3, testadas contra vBp, está mostrado na Figura 8. Quando o veneno foi administrado sozinho, a atividade de creatina quinase (CK) plasmática aumentou após 2, 4 e 8 horas, retornando aos níveis normais após 24 e 48 horas de administração intramuscular (i.m.). Quando o veneno foi pré-incubado com cada alcalóide, a atividade plasmática de CK permaneceu em níveis normais. Realizou-se analise histológica nos tempos em que houve inibição dos níveis de CK alterados com a administração do veneno.
Figura 8. Inibição da atividade miotóxica do vBp pelos compostos 1-3 da S. campaniforme. Atividade da creatina quinase (CK) plasmática é mostrada em unidades por litro (U/L). Resultados expressos como média ± S.E.M. *Significância em relação ao grupo controle, # significância em comparação com o grupo VBp (controle positivo). A análise foi realizada por ANOVA, com pós-teste de Dunnett com nível de significância de * p <0,05.
A análise histopatológica do tecido muscular estriado esquelético coletado nos tempos de 2, 4 e 8 horas, (Figuras 9, 10 e 11) revelou ausência de alterações nos grupos controle (PBS), porém, hemorragia intensa, fibras musculares em degeneração difusa, dissociação das fibras evidenciando a presença de edema e infiltrado inflamatório discreto a moderado nos grupos com o vBp.
Em todos os grupos com o veneno pré-incubado com cada alcalóide (1-3) era presente hemorragia em menor escala, fibras musculares em degeneração e regeneração focal e com infiltrado inflamatório discreto a moderado, as alterações foram menores com o decorrer do tempo.
Figura 9: Fotomicrografia de luz de uma secção transversal de 4 µm de espessura músculo esquelético gratrocnemio direito de camundongo Swiss após 2 horas de administração i.m. 50 µL dos tratamentos. A e B: PBS; C e D: VBp (50 µg/ 50 µL); E e F: VBp + 1 (1:1); G e H: VBp + 2 (1:1) e I e J: VBp + 3 (1:1). Aumentos respectivos de 100 X e 400X. F= fibra muscular normal, H= hemorragia, E= edema, I= infiltrado inflamatório,
Figura 10: Fotomicrografia de luz de uma secção transversal de 4 µm de espessura músculo estriado esquelético gratrocnemio direito de camundongo Swiss após 4 horas de administração i.m 50 µL dos tratamentos. A e B: PBS; C e D: VBp (50 µg/ 50 µL); E e F: VBp + 1 (1:1); G e H: VBp + 2 (1:1) e I e J: VBp + 3 (1:1). Aumentos respectivos de 100 X e 400X. F= fibra muscular normal, H= hemorragia, E= edema, I= infiltrado inflamatório,
Figura 11: Fotomicrografia de luz de uma secção transversal de 4 µm de espessura músculo estriado esquelético gratrocnemio direito de camundongo Swiss após 8 horas de administração i.m 50 µL dos tratamentos. A e B: PBS; C e D: VBp (50 µg/ 50 µL); E e F: VBp + 1 (1:1); G e H: VBp + 2 (1:1) e I e J: VBp + 3 (1:1). Aumentos respectivos de 100 X e 400X. F= fibra muscular normal, H= hemorragia, E= edema, I= infiltrado inflamatório,
Na figura 12 são mostradas as imagens das superfícies internas da pele dorsal de camundongos, injetadas intradermicamente (i.d.) com os tratamentos, para medição da intensidade e área hemorrágica após 2 horas e área da necrose após 72 horas, para a posterior análise histológica.
Figura 12: Fotografias das superfícies internas da pele dorsal de camundongos Swiss injetadas intradermicamente após 2 hr e 72 hr com:. A: PBS; B: VBp (50 µg/ 50 µL); C: VBp + 1 (1:1); D: VBp + 2 (1:1) e E: VBp + 3 (1:1).
A extensão da área hemorrágica do veneno (Figura 13a) foi reduzida com os três alcalóides, e a intensidade da hemorragia (Figura 13b) diminuiu quando o veneno foi pré- incubado com os alcalóides 1 e 2.
Figura 13. Atividade antihemorrágica dos compostos 1-3 isolados da S. campaniforme contra o VBp em pele de camundongo Swiss após 2 horas de administração i.d de 50 µL dos tratamentos. A: Área Hemorrágica calculado em mm2, e B: Intensidade da Hemorragia em units/mm2. Resultados expressos como média ± S.E.M. A análise foi
A análise histopatológica dos tecidos de pele foi realizada com todos os grupos tratados, após duas horas dos testes. Os controles tratados com salina não apresentaram alterações. A análise histopatológica dos cortes de pele que foram tratadas com o vBp mostrou epiderme e derme íntegras, infiltrado inflamatório misto discreto envolvendo derme e o subcutâneo, presença moderada de sangue derramado com hemácias íntegras, em toda a extensão, foco hemorrágico e infiltrado inflamatório discreto perimuscular com fibras musculares destruídas e dissociadas (edema), além de congestão vascular. O tratamento com os três alcalóides revelou epiderme e derme íntegras em toda extensão, presença discreta de sangue derramado em todas as camadas e no tecido muscular subjacente, congestão vascular. Os tratamentos com os alcalóides (1 – 3) evidenciaram um discreto infiltrado inflamatório no derma e subcutâneo e discreto infiltrado inflamatório perimuscular. Com relação às alterações em tecido muscular subjacente o veneno de Bp quando pré-incubado com o alcalóide 1 e 2, mostraram fibras musculares com menos alterações, destruição em menor quantidade, encontrando-se fibras musculares preservadas e poucas fibras alteradas em balonização. Com o alcalóide 3 identificou-se fibras musculares em degeneração, apresentando-se balonizadas (Figura 14).
Figura 14. Fotomicrografia de luz de uma secção transversal de 4 µm de espessura de pele de camundongo Swiss após 2 horas de administração i.d de 50 µL. A e B: PBS; C e D: VBp (50 µg/ 50 µL); E e F: VBp + 1 (1:1); G e H: VBp + 2 (1:1) e I e J: VBp + 3 (1:1). Aumentos respectivos de 100 X e 400X. F= fibra muscular normal, H= hemorragia, E= edema, I= infiltrado inflamatório, D= fibras em vários estágios degenerativos. GAN: Glândula anexa normal. GAA: Glândula anexa alterada. R: fibras musculares em regeneração. Coloração: H/E.
A lesão cutânea necrótica foi significativamente inibida com a presença dos alcalóides 1 e 2, como se pode visualizar na Figura 15.
Figura 15. Atividade antinecrosante dos compostos 1-3 isolados da S.campaniforme contra o vBp em pele de camundongo Swiss após 72 horas de administração i.d de 50 µL dos tratamentos.Área da pele necrótica mostrada em mm2. Resultados expressos como média ± S.E.M. A análise foi realizada por ANOVA, com pós-teste de Dunnett com nível de significância de * p <0,05.
Após 72 horas dos tratamentos, a análise histopatológica não mostrou alterações nos controles tratados com salina. Com vBp, a pele revelou epiderme destruída em toda extensão, e formação de crosta com exsudato e sangue (crosta fibrino leucocitária), além de formações vesiculares em toda extensão da epiderme e derme. Exsudato inflamatório agudo envolvendo a derme e o subcutâneo. Destruição muscular mais intensa, sem regeneração, foco hemorrágico e infiltrado inflamatório discreto perimuscular. Presença mais intensa de sangue derramado com hemácias íntegras, em toda a extensão. O tratamento com os alcalóides 1 e 2, a epiderme e a derme apresentaram-se integras em toda extensão, em contrapartida o tratamento com o alcalóide 3 mostrou formação de crosta na maior parte da extensão da epiderme. Na derme, subcutâneo e na região perimuscular encontrou-se discreto infiltrado inflamatório misto (polimorfonucleares e mononucleares) discreto sangue derramado com
hemácias íntegras com todos os três alcalóides. No tecido muscular subjacente, apenas com o alcalóide 1 evidenciou-se moderada destruição muscular, com presença de fibras balonizadas e regeneradas e tecido de granulação. Predominância de fibras balonizadas, com algumas em regeneração, além de tecido de granulação, foram evidenciados nos tratamentos com os alcalóides 2 e 3 (Figura 16).
Figura 16: Fotomicrografia de luz de uma secção transversal de 4 µm de espessura pele de camundongo Swiss após 72 horas de administração i.d de 50 µL. A e B: PBS; C e D: VBp (50 µg/ 50 µL); E e F: VBp + 1 (1:1); G e H: VBp + 2 (1:1) e I e J: VBp + 3 (1:1). Aumentos respectivos de 100 X e 400X. F= fibra muscular normal, H= hemorragia, E= edema, I= infiltrado inflamatório, D= fibras em vários estágios degenerativos. C: crosta fibrino leucocitária. GAN: Glândula anexa normal. GAA: Glândula anexa alterada. R: fibras musculares em regeneração. Coloração: H/E.