Inibidores de DNMTs como agentes terapêuticos

A ideia atrativa de que os genes podem ser transcricionalmente ativados através da remoção da metilação do DNA tem sido confirmada ao longo dos anos e tem relançado o interesse na epigenética e na sua capacidade em regular a expressão génica e os fenótipos. Muitas correlações entre a expressão e a perda de metilação do DNA têm sido reportadas, tendo sido estabelecida uma associação clara entre a desmetilação do DNA e a ativação transcricional (Jaenisch e Bird, 2003; Yang et al., 2010).

O processo da metilação das citosinas é reversível e pode ser alterado por manipulação biológica e bioquímica, o que o torna um alvo atrativo para intervenção terapêutica (Palli et al., 2008; Yang et al., 2010). O fundamento por detrás das terapias de desmetilação é a capacidade de inibidores de DNMTS (DNMTIs) reverterem o silenciamento génico induzido pela hipermetilação, e assim restaurar o controlo da proliferação celular e sensibilidade à apoptose (Palli et al., 2008).

Os inibidores das DNMTs atuam ao impedir a re-metilação (manutenção dos níveis de metilação) após cada ronda de replicação do DNA, o que resulta na progressiva desmetilação do genoma e consequente reativação generalizada da expressão génica (Palli

et al., 2008). Este efeito na expressão génica pode então apresentar efeitos pleiotrópicos na

biologia celular do cancro, incluindo a indução (ou facilitação) da diferenciação, apoptose, senescência e resposta imunitária (Issa, 2007).

Os inibidores da metilação do DNA podem ser agrupados em três classes: (a) inibidores análogos de nucleósidos; (b) inibidores não análogos de nucleósidos; e (c) oligonucleótidos antisense. Os DNMTIs análogos de nucleósidos mais conhecidos são a azacitidina, decitabine e zebularina, os quais serão abordados em pormenor mais à frente. Dentro da classe dos DNMTIs não análogos de nucleósidos encontram-se a hidralazina, procainamida, procaina, EGCG e RG108. Estes primeiros três compostos atuam como agentes terapêuticos ao ligarem-se às ilhas CpG e impedirem a ação das DNMTs. Por sua vez, o EGCG e o RG108 ligam-se às DNMTs no centro ativo, impedindo que elas atuem no DNA (Figura I.5.6.1). A última classe de DNMTIs consiste em oligonucleótidos

antisense que se ligam às DNMTs por complementaridade, inativando-as (Issa, 2007). Um

exemplo recente é o inibidor antisense da DNMT1, que cliva o mRNA desta metiltransferase, impedindo a sua ação (Ferreira et al., 2013).

53 Figura I.5.6.1 - Inibidores de DNMTs e os seus mecanismos inibitórios.

Os inibidores análogos de nucleósidos 5’-azacitidina, 5’-aza-2’-deoxicitidina e zebularina são extensivamente metabolizados antes de serem incorporados no DNA. Após a incorporação, esses compostos funcionam como substratos suicidas para as DNMTs. Os inibidores não análogos de nucleósidos Procaina, EGCG e o RG108 inibem as DNMTs através do bloqueio do local ativo da enzima (EGCG e RG 108), ou impedindo o reconhecimento pela enzima da sequência alvo no DNA (Procaina) [Adaptado de Lyko e Brown, 2005].

Os inibidores das DNMTs (DNMTIs) atualmente disponíveis, como a 5’- azacitidina (azacitidina, AZA) e a 5-aza-2'-deoxycitidine (decitabine) são análogos de citosinas, denominados por azanucleósidos, que apresentam um mecanismo de inibição similar (Palli et al., 2008).

Após a entrada na célula, os azanucleósidos têm de ser ativados e metabolicamente convertidos no nucleótido ativo para a inibição da metilação do DNA, 5’-aza- 2´deoxicitidine-5'-trifosfato. E uma vez ativos no interior da célula, eles tornam-se substratos para a maquinaria da replicação do DNA, sendo posteriormente incorporados no

54

DNA, onde a citosina é substituída pela azacitosina. Os dinucleótidos azacitosina-guanina são então reconhecidos pelas DNMTs como naturais substratos e as enzimas iniciam a reação de metilação. É assim estabelecida uma ligação covalente entre o DNA e a enzima, que devido à azacitosina é impossível de ser desfeita, ficando a enzima permanentemente ligada ao DNA, sendo a sua função de DNA metiltransferase bloqueada. Para além disso, a ligação covalente da proteína compromete ainda a funcionalidade do DNA, sendo detetada como um dano no DNA, que resulta posteriormente na degradação da DNMT aprisionada. Como consequência direta da depleção dos níveis de DNMTs, as marcas de metilação vão sendo perdidas durante a replicação do DNA, levando à desmetilação progressiva do genoma (Stresemann e Lyko, 2008; Palli et al., 2008).

Estudos recentes têm descrito, ainda, o efeito do tratamento com estes compostos na indução de danos no DNA (Stresemann e Lyko, 2008; Maslov et al., 2012). Foi reportado em particular que o decitabine causa, em linhas celulares tumorais humanas, a formação de quebras de cadeia dupla no DNA, as quais não são reparadas devido à inibição da mediação da resposta a danos celulares pela DNMT1. A indução de danos no DNA por estes azanucleósidos, combinada com o não envolvimento da DNMT1 na reparação do DNA, indica que os padrões de desmetilação induzidos pelos compostos podem ser influenciados por mecanismos de reparação do DNA (Stresemann e Lyko, 2008).

A abundância de genes e vias afetadas pela metilação do DNA torna este alvo terapêutico altamente não específico nos seus efeitos. A exposição das células à azacitina resulta invariavelmente na desmetilação global do genoma, em vez de levar apenas à desmetilação de genes específicos. Assim, diferentes genes podem ser reativados, nomeadamente genes estimuladores da proliferação celular (que estariam normalmente silenciados), existindo também o risco da ativação de vias de resistência ao fármaco (Issa, 2007). Outra consequência bem documentada da deficiência na desmetilação do DNA é a ativação de elementos transponíveis. Tal como grande parte do genoma dos mamíferos, as sequências relacionadas com elementos transponíveis encontram-se altamente metiladas e transcricionalmente silenciadas em células somáticas. A ativação dos promotores de elementos transponíveis como LINEs e SINEs, ocorre como consequência de hipometilação, conduzindo à instabilidade cromossómica (Bird, 2002).

Apesar de todos estes efeitos inespecíficos do tratamento com DNMTIs, a eficácia terapêutica da terapia de hipometilação é uma realidade e está relacionada com o facto das

55 células tumorais dependerem muito mais do silenciamento epigenético (p.ex. silenciamento de genes supressores tumorais) para o seu fenótipo, do que células normais (Issa, 2007; Yang et al., 2010). Estes inibidores apresentam uma ação preferencial sobre as células cancerosas, na medida em que são incorporados mais rapidamente nessas células, devido à elevada taxa de divisão celular (Ellis et al., 2009).

Na realidade, tanto a azacitidina, como o decitabine, têm sido estabelecidos como inibidores potentes da metilação do DNA, em modelos pré-clínicos e em pacientes com cancro. Ambos os compostos têm mostrado benefícios clínicos significativos numa variedade de ensaios clínicos, tendo recebido aprovação da FDA (―Food and Drug Administration‖) para o tratamento da Síndrome Mielodisplástico (Issa et al., 2005; Ellis et

al., 2009).

Apesar de vários estudos terem já demonstrado que ambos os compostos são eficazes na inibição da metilação do DNA, tem-se tornado também claro que o seu modo de ação não se limita à desmetilação do DNA (Schaefer et al., 2009). Devido ao facto da azacitidina ser um ribonucleósido, o seu alvo primário é o RNA celular, em vez do DNA (Glover e Leyland-Jones, 1987; Issa et al., 2005). Nesse sentido, assume-se que a 5’- azacitidina apresenta um mecanismo de ação dupla: em doses reduzidas, leva à hipometilação do DNA; em doses elevadas, provoca toxicidade, devido à incorporação no RNA e interação com a biossíntese de proteínas (Gronbaek et al., 2007). Ao incorporar-se no RNA, este composto pode inibir o processamento do RNA ribossomal de elevado peso molecular e separar os polirribossomas, levando à inibição da síntese proteica (Oki et al, 2007). Num estudo mais recente, Schaefer e colaboradores (2009) descobriram ainda que a azacitidina inibe a ação da RNA metiltransferase DNMT2, levando à desmetilação do RNA (Schaefer et al., 2009). Contudo, os efeitos da incorporação deste agente desmetilante ao nível do RNA ainda são em grande parte desconhecidos (Issa et al., 2005; Schaefer et al., 2009).

Por outro lado, a 5’-azacitidina pode acelerar o tempo de replicação da heterocromatina e alterar o padrão de replicação de bandas cromossómicas individuais, podendo também provocar diferenciação celular, o que pode conduzir ao aparecimento de novos fenótipos (Haaf, 1995). Estudos iniciais descrevem, ainda, que a 5’-azacitidina pode provocar amplificação de genes específicos (Perry et al, 1992; Haaf, 1995).