Instruções para a coleta dos cabelos

Considerando-se que o CORT pode ser mensurado a partir de amostras de fios de cabelos, recomenda-se que deve ser cortado na região do vértice posterior da cabeça, o mais próximo possível da raiz, devido ser a área com a menor variabilidade da taxa de crescimento e possuir a maior concentração de cortisol. O comprimento e a quantidade de fios coletados variam de acordo com os objetivos propostos e poucos estudos levam em consideração as diferenças étnicas em relação ao crescimento, mas, a maioria, prioriza o uso de fios de 3 (cm) de comprimento (PAZA et al., 2017).

Contudo, verifica-se a ausência de um método único quanto aos procedimentos para a coleta dessas amostras de cabelo e o tratamento dos fios antes de se realizar as análises, ou seja, não há um protocolo padronizado, utilizado para extração e análise do CORT, o que dificulta a comparação dos resultados encontrados (PAZA et al, 2017). Assim, estudos utilizam o composto isopropanol para a lavagem, pulverização e análise da concentração de cortisol com amostras de cabelo usando três principais métodos disponíveis comercialmente entre eles o CLIA (Método da Quimioluminescência), o ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) e o LC- MS/MS (Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas - Liquid

chromatography–mass spectrometry) (PAZA et al., 2017).

Neste estudo foi utilizado o método ELISA, conforme as instruções do fabricante, no kit específico Cortisol ELISA, ensaio usado para a quantificação de cortisol em urina, plasma e outras matrizes de amostra; contudo já foi validado para amostras de cabelos. Foram obtidas 164 amostras de cabelo para a dosagem do

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CORT, cortadas com tesoura cirúrgica na região do vértice posterior da cabeça, o mais próximo possível da raiz (PAZA et al, 2017).

Dessa forma, era separada uma mecha de cabelo abaixo da base do crânio. Em alguns casos, teve-se que cortar o cabelo em vários locais na mesma região. Obteve-se fios de 3 cm de comprimento, conforme recomendações (PAZA et al., 2017; GOLDBERG et al., 2014). Após, as amostras eram fixadas em cartão específico fornecido pelo laboratório, de acordo com as instruções do fabricante (Anexo C - etapa 5) e com o bulbo capilar voltado para cima.

Sumarizando-se, as etapas para a coleta de mechas de cabelos obedeceram a seguinte sequência:

 Separação horizontal no cabelo usando prendedores, na parte de trás da cabeça. Era separada uma mecha de cabelo (espessura de um lápis, 0,5 centímetros) a 2 cm abaixo da base do crânio.

 Fixação da mecha de cabelo de 2 cm a partir da raiz. Se o cabelo era muito curto ou muito fino, solicitava-se ao trabalhador para fazer um movimento em ziguezague do cabelo antes de prendê-lo com o grampo; para evitar deixar uma falha de cabelo visível na cabeça, também se podia cortar o cabelo em vários locais na mesma região, a fim de obter a mesma quantidade de cabelo.  No grampo, a largura da mecha de cabelo deveria ser de 1 cm; usando a tesoura, o cabelo deveria ser cortado tão perto do couro cabeludo quanto possível.

 Enquanto o cabelo ainda estava no grampo, colocava-se a mecha no cartão com a raiz para cima. Usando fita adesiva, prendia-se a mecha de cabelo no cartão. A raiz capilar deveria ser posicionada de acordo com as setas nas bordas do cartão.

 Identificada a amostra, o cartão era colocado em uma embalagem zip lock (fabricada em polietileno de alta densidade - PEAD - e polietileno de baixa densidade – PEBD) e dentro de um envelope. Eram armazenadas as amostras à temperatura ambiente, em lugar seco e no escuro para evitar a sua contaminação e enviadas ao laboratório especializado.

A largura da mecha deveria ter uma quantidade que correspondesse, minimamente, a 30 miligramas (mg) de cabelo por participante. As amostras foram, então, acondicionadas em envelopes e caixas específicas para evitar a sua

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contaminação e enviadas para a análise do CORT. Os valores de referência utilizados nesse estudo foram os do laboratório de análises clínicas (ROCKY MOUNTAIN ANALYTICS, 2014) onde o método para extrair o CORT foi similar ao do presente estudo. Os valores considerados são: cortisol abaixo do normal até 16 picogramas de cortisol/miligramas de cabelos (pg/mg), normal de 16 à 84 pg/mg e acima do normal, valores maiores que 84 pg/mg.

As etapas laboratoriais realizadas foram as seguintes:

 para o processamento das amostras e detecção do cortisol: foram utilizados 30 miligramas (mg) de cabelo de cada amostra; após foram realizadas duas lavagens com 40 mililitros (ml) de água destilada, seguidas de duas lavagens com 40 ml de metanol para remover qualquer sujidade, em uma placa rotativa a 160 rotações por minuto (rpm) durante 3 minutos por lavagem. O composto isopropanol é utilizado para a lavagem das amostras e a análise da concentração de cortisol é realizada incluindo o método ELISA (PAZA et al., 2017);

 posteriormente a cada conjunto de lavagens, após a secagem, as amostras de cabelo foram picotadas empregando-se tesouras cirúrgicas;

 após, as amostras foram incubadas por 18 horas a 50°C com agitação de 160 rpm;

 seguida da incubação, as amostras foram centrifugadas durante 30 minutos (min) a 3.000 rpm; uma vez que o metanol foi removido, a amostra foi suspensa em 200 microlitros (μl) de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a pH 7,0;

 após, foram adicionados os reagentes químicos “STOP” - a Solução Stop é um reagente de parada para reações colorimétricas - (a reação da enzima termina pela adição da solução de “STOP”) e o “TMB” - substrato cromogênico estabilizado, que contem tetrametilbencidina (TMB), para o uso em imunoensaios à base de peroxidase de rábano - (esse cromogeno “resgata” a cor na reação entre o antígeno e o conjugado). Assim, as amostras foram agitadas no aparelho vortex durante 1 min, para a detecção e medição do cortisol;

 a leitura do kit é convertida em picograma (pg) de cortisol por miligrama (mg) de peso do cabelo em pó (MEYER et al., 2014).

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Conforme já descrito, o kit mencionado está comercialmente disponível (ELISA/KAPDB 290); foi validado pelo fabricante para dosagem em saliva, porém, também, foi validado para cabelos pelo laboratório, com o acompanhamento do Hospital Universitário da Universidade de São Paulo (USP) e da Universidade de Harvard dos Estados Unidos da América. Para esta validação foi usado um n de 1120 amostras, portanto, o kit pode ser utilizado com amostras de cabelo (LIU et al., 2017).