Integridade e polaridade das membranas celulares

A integridade da membrana citoplasmática e a polaridade das membranas citoplasmática e mitocondrial

simultâneo, com base na combinação de dois fluorocromos distintos (IP), que cora a membrana citoplasmática quando as células estão detectado em FL3, e o iodeto de 3,3’

exterior das membranas quando as célu FL1.

Na Figura 4.16. podem observar

de levedura na fase exponencial, na fase estacionária e na fase de morte, para os ensaios realizados sem inibidor e com concentrações crescentes de inibidor.

no ponto anterior, as medições realizadas na fase de latência são apresentadas. B B A A b) T=24h d) T=72h

Gráficos de densidade das células de S. carlsbergensis coradas com DHR fermentação na presença de inibidor 20 g.L-1 após 6h de fermentação a), após 24h b) após

inferior a 1% pois examinaram-se 10000 eventos).

e polaridade das membranas celulares

integridade da membrana citoplasmática e a polaridade das membranas citoplasmática e mitocondrial das células de S. carlsbergensis foram analisadas em simultâneo, com base na combinação de dois fluorocromos distintos, o iodeto de

membrana citoplasmática quando as células estão permeabilizadas , e o iodeto de 3,3’-dihexiloxacarbocianina (DIOC6(3)), que se acumula no

exterior das membranas quando as células se encontram despolarizadas e

podem observar-se os gráficos de densidade correspondentes a células levedura na fase exponencial, na fase estacionária e na fase de morte, para os ensaios

e com concentrações crescentes de inibidor. Tal como foi exp no ponto anterior, as medições realizadas na fase de latência são imprecisas, pelo que

B B A

A

44 coradas com DHR-123, durante a após 48h c) e após 72h d).

integridade da membrana citoplasmática e a polaridade das membranas foram analisadas em , o iodeto de propídio permeabilizadas e é (3)), que se acumula no las se encontram despolarizadas e é detectado em

se os gráficos de densidade correspondentes a células levedura na fase exponencial, na fase estacionária e na fase de morte, para os ensaios Tal como foi explicado são imprecisas, pelo que não

Fase Exponencial a) 0 g.L-1 de ácido acético b) 0,5 g.L-1 de ácido acético c) 1 g.L-1 de ácido acético A D A A D D B C B C C B

Fase Estacionária Fase de Morte

de ácido acético D A A A A A A D B D B C B C B B C B 45 Fase de Morte A A A D D D C B B C B C

Fase Exponencial

d) 5 g.L-1 de ácido acético

e) 10 g.L-1 de ácido acético

f) 15 g.L-1 de ácido acético

Figura 4.16. Gráficos de densidade

exponencial, na fase estacionária e na fase de morte com 1 g.L-1 inibidor; d) com 5 g.L-1

variação foi inferior a 1% pois examinaram

B B C C A D A D C B D A

Fase Estacionária Fase de Morte

Gráficos de densidade das células de S. carlsbergensis coradas com IP e DiOC exponencial, na fase estacionária e na fase de morte: a) na ausência de inibidor; b) com 0,5 g.

inibidor; e) com 10 g.L-1 inibidor; f) com 15 g.L-1 inibidor ior a 1% pois examinaram-se 10000 eventos).

B B C C A D D A B B A C D A 46 Fase de Morte

coradas com IP e DiOC6(3), na fase

com 0,5 g.L-1 de inibidor; c) inibidor. (O coeficiente de B C A D C B A D

47 No ensaio sem adição de inibidor (Fig.4.16.a) observou-se que a proporção de células com as membranas citoplasmática e mitocondrial intactas e polarizadas (A) foi diminuindo da fase exponencial para a fase estacionária e para a fase de morte, sucedendo o inverso com a percentagem de células com as membranas permeabilizadas e em estado de lise avançada (D) e verificou-se, também, que a proporção de células com membranas citoplasmática e mitocondrial intactas mas despolarizadas (B) foi aumentando. Tal observação sugere que as membranas despolarizaram e foram perdendo integridade durante a fermentação, devido ao esgotamento da fonte de carbono (Fig. 4.2.) e à acidificação do meio (Fig.4.3.).

Durante a fase exponencial e, comparativamente com o ensaio sem adição de inibidor, a subpopulação de células com as membranas intactas e polarizadas (A) foi diminuindo e a subpopulação de células com as membranas intactas mas despolarizadas (B) e de células despolarizadas e em lise avançada (D) foi aumentando com a adição de concentrações crescentes de ácido acético, atingindo um máximo no ensaio com 15 g.L-1 (Fig. 4.16.f). Estes resultados sugerem que a presença deste inibidor induziu um nível de stress tal nas células de S. carlsbergensis durante a fase exponencial, provocando a permeabilização da membrana citoplasmática e a despolarização das membranas citoplasmática e mitocondrial.

Verifica-se que a proporção de células com as membranas intactas mas despolarizadas (B) na fase estacionária é inferior à das células no mesmo estado fisiológico, na fase exponencial, ao longo dos ensaios realizados, sucedendo o inverso com a subpopulação de células com membranas polarizadas e intactas (A), o que pode ser explicado pelas condições nutricionais favoráveis durante a fase exponencial, permitindo que as células apresentem uma maior capacidade de resistência à presença do ácido acético, o que não acontece quando a cultura atinge a fase estacionária. Contudo, a elevada percentagem de células afectadas (B), (C) e (D), entre 67% no ensaio com 0,5 g.L-1 e 96,3% no ensaio com 15 g.L-1, revelam o impacto deste inibidor no potencial das membranas citoplasmáticas e mitocondriais das células da levedura. Supreendentemente, a presença de uma elevada percentagem células nestes estados fisiológicos de stress não influiu na produção de etanol, tendo-se obtido concentrações em etanol semelhantes nos ensaios com adição de concentrações entre 5 e 15 g.L-1 de ácido acético (Fig. 4.5.), ainda que, no ensaio com 15 g.L-1 de inibidor, a produção máxima em etanol tenha sido atingida mais tarde que nas restantes fermentações (Fig. 4.5.).

Para além do efeito de inibição provocado pela sua forma não dissociada, que atravessa a membrana citoplasmática através de difusão passiva, o ácido acético e outros ácidos fracos têm, também, impacto sobre as funções das membranas celulares e a organização dos lípidos, devido ao facto de se tornarem mais inibidores conforme se tornam mais hidrofóbicos. O resultado é a permeabilização das membranas citoplasmáticas, bem como

perturbações na funcionalidade das proteínas das mesmas.

membranas citoplasmáticas das células provoca um aumento da permeabilidade destas aos iões e outros metabolitos, levando à estimulação da difusão passiva dos prot

exterior para o citosol, contribuindo para a redução do seu pH e para a dissipação do potencial electroquímico mantido pela membrana

síntese de DNA e RNA, a inibição da actividade metabólica e a ruptura do gradiente protiónico mantido através da membrana

resultados obtidos.

Como seria expectável na fase de morte, a proporção de células avançada é muito superior à das f

Na fermentação em presença de ácido acético com uma concentração de 20 g.L como foi referido no ponto anterior, a levedura não ultrapassou a fase

de tempo em que esta ocorreu.

a) T= 6h

c) T=48h

Figura 4.17. Gráficos de densidade

fermentação na presença de inibidor 20 g.L de variação foi inferior a 1% pois examinaram

A

B

B A

a funcionalidade das proteínas das mesmas. A perda da integridade das membranas citoplasmáticas das células provoca um aumento da permeabilidade destas aos iões e outros metabolitos, levando à estimulação da difusão passiva dos prot

a o citosol, contribuindo para a redução do seu pH e para a dissipação do electroquímico mantido pela membrana. O resultado final é a diminuição da síntese de DNA e RNA, a inibição da actividade metabólica e a ruptura do gradiente ido através da membrana (Mira et al., 2010), o que pode explicar os

na fase de morte, a proporção de células em estado de lise avançada é muito superior à das fases exponencial e estacionária, em todos os ensaios.

Na fermentação em presença de ácido acético com uma concentração de 20 g.L anterior, a levedura não ultrapassou a fase de latência de tempo em que esta ocorreu.

b) T=24h

d) T=72h

Gráficos de densidade das células de S. carlsbergensis coradas com IP e DiOC fermentação na presença de inibidor 20 g.L-1: a) após 6h; b) após 24h; c) após 48h e d) após 72h

nferior a 1% pois examinaram-se 10000 eventos).

D C B A D C D C D A B C 48 A perda da integridade das membranas citoplasmáticas das células provoca um aumento da permeabilidade destas aos iões e outros metabolitos, levando à estimulação da difusão passiva dos protões desde o a o citosol, contribuindo para a redução do seu pH e para a dissipação do . O resultado final é a diminuição da síntese de DNA e RNA, a inibição da actividade metabólica e a ruptura do gradiente , o que pode explicar os

em estado de lise ases exponencial e estacionária, em todos os ensaios. Na fermentação em presença de ácido acético com uma concentração de 20 g.L-1, tal

de latência no período

coradas com IP e DiOC6(3), durante a

49 Como se pode observar na Figura 4.17., destaca-se a subpopulação (B), sendo que as subpopulações (A), (C) e (D) foram gradualmente aumentando com o período de tempo em que o ensaio decorreu, provavelmente em resultado do consumo de glucose. Observou-se que a concentração de ácido acético induziu a perda do potencial electroquímico das células, o que é coincidente com uma redução bastante significativa da produção de etanol (Fig. 4.5; Tab. 4.3.). Estes resultados sugerem que as células de S. carlsbergensis limitaram-se a consumir glucose suficiente para assegurar a energia necessária à manutenção da sua actividade metabólica e tentar manter a sua viabilidade, o que se se reflectiu na baixa percentagem de células das subpopulações (C) e (D).

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