Interação com o DNA

Diante da atividade catalítica observada pelos complexos frente à hidrólise do substrato ativado BDNPP, decidiu-se estudar a interação dos mesmos com o DNA, investigando a promissora ação dos complexos como nucleases. Tais estudos foram realizados para todos os complexos (1-5).

Os testes de clivagem de DNA em função do pH (6,1 a 9,0) foram realizados para diferentes concentrações dos complexos (1x10-6 a 1,6x10-4 mol L-1), utilizando-se 4x10-5 mol L-1 de pb do DNA plasmidial (pBSK-II), em torno de 6 horas de incubação a 50 °C. A Figura 44 ilustra tal experimento, exemplificado para os complexos 2, 4 e 5, onde nitidamente é possível observar as atividades de clivagem no DNA plasmidial dos complexos, sendo capazes de promover a clivagem da forma superenovelada (forma I) para a forma circular (forma II) e forma linear (forma III) do DNA plasmidial, demonstrando, nesse último caso, a capacidade dos complexos em cortar ambas as fitas do DNA (numa distância entre os cortes de no máximo 12 pares de base).

complexo 2 a complexo 4 b complexo 5 c

Figura 44. Clivagem de DNA plasmidial (pBSK-II, 40 µM pb) promovida por diferentes

concentrações dos complexos 2, 4 e 5 em diferentes valores de pH (PIPES), a 50 °C e incubação em média de 6 horas. Condições: poços 1 = controle, somente DNA; a _{poços 2-5 = DNA + [complexo 2] =}

20, 40, 80 e 160 µM, respectivamente; A-D = pH 6,1; 6,5; 7,0 e 7,5, respectivamente. b _{poços 2-6 =}

DNA + [complexo 4] = 5, 10, 20, 30 e 60 µM, respectivamente; A = pH 8,0 e B = pH 9,0; c _{poços 2-7}

= DNA + [complexo 5] = 10, 20, 30, 60, 90 e 125 µM, respectivamente; A-D = pH 6,5; 7,0; 7,5 e 8,0 respectivamente.

Os complexos 1-3 apresentaram maior atividade frente à clivagem do DNA em pH 7, resultado, esse, idêntico ao observado na hidrólise do substrato BDNPP promovida pelos mesmos complexos, onde acredita-se que a espécie binuclear [Ln2(OH)H-1L1]3+ (Ln = TbIII,

GdIII ou EuIII) seja a principal espécie presente em solução nesse valor de pH e, conseqüentemente, a espécie responsável pela catálise (seção 4.6.1.1).

Já o complexo 4 apresentou maior atividade em pH 8,0. Embora estudos cinéticos com o substrato BDNPP não foram possíveis de serem realizados com tal complexo, esse resultado, observado frente à clivagem do DNA, está de acordo com os estudos potenciométricos (Tabela 14, seção 4.5.2) que demonstram a formação da espécie binuclear [La2(OH)H-1L1]3+ somente em valores maiores de pH (acima de 7,5), quando comparado aos

complexos 1-3.

O complexo 5, por sua vez, apresentou maior atividade frente à clivagem do DNA plasmidial em pH 7. É interessante notar que tal complexo trinuclear de gadolíneo apresenta um valor de pH ótimo uma unidade maior do que o observado frente à hidrólise do BDNPP. Faixa essa de pH, entretanto, em que a espécie sugerida como mais ativa [Gd3(OH)(L2)2]2+

(seção 4.6.2.1) ainda é predominante.

Dessa maneira, a partir dos valores de pH ótimo da reação dos complexos frente à clivagem do DNA plasmidial, os estudos cinéticos em condições de excesso de complexo a 50 °C foram realizados (monitorando o decréscimo da forma superenovelada), onde os parâmetros cinéticos obtidos para os complexos 1-5 podem ser observados na Tabela 24.

Tabela 24. Parâmetros cinéticos obtidos na reação de clivagem de DNA plasmidial catalisada pelos

complexos 1-5 a 50 ºC. KM (mol L-1) kcat (h-1) E = kcat/ KM (mol-1 L h-1) f = kcat/knc 1a 5,2x10-6 0,89 1,7x105 2,5x107 2a 2,5x10-5 0,47 1,8x104 1,7x107 3 a 3,7x10-5 0,73 2,0x104 2,0x107 4c 4,6x10-5 0,24 5,2x103 6,7x106 5a 2,8x10-3 22,48 8,1x103 6,24x108 a _{pH 7,0; e} c _{pH 8,0.}

A análise desses dados para os complexos 1-4 mostra uma aceleração de 6,7x106 a 2,5x107 vezes, em relação à reação estimada não catalisada de clivagem do DNA112. Dessa maneira, esses complexos apresentam-se tão reativos quanto outros exemplos de complexos binucleares com íons lantanídeos capazes de clivar o DNA, relatados na literatura45.

É possível observar ainda que o complexo 1 é o mais ativo, comparado aos complexos 2-4, comportamento, esse, contrário ao observado frente à hidrólise do substrato BDNPP. O

que indica os complexos atuarem nas hidrólises do BDNPP e do DNA em passos mecanísticos distintos, evidenciando que os complexos não necessariamente atuam da mesma maneira em substratos modelos e diante das macromoléculas do DNA. Tal evidência é também observada na literatura: um bom exemplo é um complexo binuclear de ferro(III) que não apresenta atividade hidrolítica diante de ésteres de fosfato simples, mas é capaz de promover a clivagem do DNA em condições brandas de temperatura e pH113.

É interessante notar que o complexo 5 apresentou uma constante de velocidade de 22,48 h-1, o que representa uma aceleração de 6,24x108 vezes na velocidade da reação comparada com a velocidade de hidrólise do DNA não catalisada.

Com intuito de investigar o mecanismo de ação dos complexos 1-5 frente à clivagem do DNA, se por via hidrolítica ou oxidativa, experimentos foram realizados na presença de dimetilsulfóxido, um captador de radicais livres. Para todos os complexos (Figura 45, exemplificado para o complexo 5) nenhuma interferência em suas atividades foi observada na presença de DMSO, indicando a ausência de radicais hidroxil envolvidos na clivagem do DNA plasmidial. O que está de acordo com a conhecida ação dos íons lantanídeos em clivar hidroliticamente ésteres de fosfato28,114.

0 20 40 60 80 100 F II F III % D N A s upe reno ve lado 0 μM 20 μM 30 μM 60 μM Controles DMSO F I

Figura 45. Efeito do captador de radicais livres, DMSO, na reação de clivagem do DNA plasmidial

(pBSK-II, 40 µM pb) catalisada pelo complexo 5, incubação de 5 horas a 50 ºC em pH 7 (PIPES).

Dando continuidade à investigação mecanística dos complexos 1-5 frente à clivagem do DNA plasmidial, estudos com Distamicina, um ligante específico do sulco menor do

113 _{A. NEVES, H. TERENZI, R. HORNER, A. HORN Jr., B. SZPOGANICZ, and J. SUGAI. Hydrolytic DNA} Cleavage Promoted by a Dinuclear Iron(III) Complex. Inorg. Chem. Comm., v. 4, p. 388-391 (2001).

114 _{U. BAYKAL, and E. U. AKKAYA. Synthesis and Phosphodiester Transesterification Activity of the La}3+_- Complex of a Novel Functionalized Octadentate Ligand. Tetrahedron Lett., v. 39, p. 5861-5864 (1998).

DNA115, foram realizados. Os experimentos foram feitos mediante sua incubação prévia com DNA (4x10-5 mol L-1 pb) por 30 minutos à temperatura ambiente com conseguinte adição do respectivo complexo, sendo incubado por aproximadamente mais 6 horas a 50 °C. Os resultados indicam que os complexos 1 e 3 são regioespecíficos, se ligando basicamente ao sulco menor do DNA (praticamente 100% das atividades dos complexos foram inibidas com a adição da Distamicina). Já os complexos 2 e 4 não apresentaram especificidade com relação ao local de ligação ao DNA, pois a adição de Distamicina inibiu parcialmente as atividades desses complexos, indicando, dessa maneira, que a clivagem catalisada por 2 e 4 ocorre tanto mediante o sulco menor como pelo sulco maior do DNA. Já o complexo 5 não teve sua atividade catalítica influenciada pela adição da Distamicina (Figura 46), apresentando, dessa maneira, especificidade pelo sulco maior do DNA plasmidial.

0 20 40 60 80 100 F II F III % DNA s uperenovelado 0 μM 20 μM 30 μM 60 μM Controles Distamicina F I

Figura 46. Análise de clivagem de DNA plasmidial (pBSK-II, 40 µM pb), catalisada pelo complexo 5, diante a ausência e a presença do reagente intercalante Distamicina (40 µM), com incubação de 5

horas a 50 ºC, em pH 7 (PIPES).