Interações bacterianas e a clorose variegada dos citros

O Brasil é o maior produtor mundial de laranjas e controla grande parte do mercado internacional do suco concentrado desta fruta. Neste contexto, os pomares paulistas representam mais de 80% da produção nacional, que gera divisas da ordem de 1,5 bilhão de dólares ao ano e emprega mais de 3,4 milhões de pessoas em sua cadeia produtiva (Araújo et al., 2002). Porém, o cultivo da laranjeira é dificultado pela ocorrência de diversas pragas e doenças. A clorose variegada dos citros (CVC) (também conhecida como amarelinho) é uma doença da laranja (Citrus sinensis) e outros citros comerciais causada pela bactéria Xylella fastidiosa, que normalmente se limita ao xilema desta planta. Trata-se da principal doença da citricultura paulista, e estima-se que as perdas provocadas por esta doença são da ordem de centenas de milhões de reais ao ano (Lacava et al., 2004; Laranjeira et al., 2003). Os pomares das regiões norte e noroeste do estado de São Paulo são os mais atingidos pela doença, que em determinadas localidades ataca até 70% dos pomares (Figura 8).

Figura 8. Zoneamento agrícola de incidência da clorose variegada dos citros no estado de São Paulo e sul de Minas Gerais em 2005. Fonte: Fundecitrus

(http://www.fundecitrus.com.br)

As plantas afetadas pela CVC apresentam clorose foliar semelhante à deficiência de zinco, que se inicia na parte superior da copa. Na face inferior das folhas desenvolvem-se pontuações pequenas, de cor marrom claro, que podem se tornar marrom escuro ou mesmo necróticas (Lee et al., 1991; Rossetti, 1993) (Figuras 9, 10). A doença causa redução do tamanho dos frutos, endurecimento da casca, maturação precoce e menor resistência ao sol não podendo ser utilizados pela indústria de sucos (Site Fundecitrus). O crescimento da planta é mais lento, ocasionando morte dos ponteiros e queda das folhas (Lee et al., 1991). A bactéria, além de ser carreada através de material vegetal infectado, é transmitida de planta a planta por meio de insetos vetores que se alimentam de seiva do xilema, conhecidos como cigarrinhas, pertencentes às famílias Cercopidae e Cicadellidae (Lopes, 1999).

Folhas com sintomas de CVC (pequenas manchas amareladas)

Estágio mais avançado lesões de cor palha

Desfolha dos ramos mais altos da planta

Frutos sadios ao lado de frutos de tamanho reduzido devido à doença

Sintomas de murcha em folhas e queimadura do sol em frutos

Detalhe de murcha em folhas e queimadura do sol em frutos

Figura 9. Efeitos da clorose variegada dos citros nas folhas e frutos de laranjeira. A doença aumenta a suscetibilidade dos frutos aos raios solares.

Fonte: site Fundecitrus (www.fundecitrus.com.br).

A laranjeira não é a única espécie vegetal prejudicada por doenças causadas por X. fastidiosa. Já foram reportados ataques sobre videiras, alface, pessegueiros, vinca, amêndoas, pecan, café entre outros (Purcell e Hopkins, 1996). Isto demonstra claramente a importância desta bactéria no meio rural e a necessidade urgente de novos estudos visando uma melhor compreensão das doenças a ela relacionadas.

Figura 10. Micrografia de eletrônica varredura mostrando a bactéria X. fastidiosa colonizando o interior do xilema da laranjeira. Fonte: E. W.

Kitajima (Esalq).

Apesar da Xylella fastidiosa ter sido o primeiro fitopatógeno a ter sua

sequência genética decifrada, ainda não surgiram metodologias de controle da doença da clorose variegada (Simpson et al., 2000). Entretanto, em alguns pomares infectados é possível encontrar alguns poucos exemplares sadios e resistentes à doença. Estas plantas assintomáticas podem ser encontradas nas mesmas áreas de cultivo e são genotipicamente idênticas às plantas doentes, indicando que algum outro fator confere a estas plantas resistência a doença. Um destes fatores pode ser a natureza da comunidade endofitica microbiana que coloniza cada planta individual de laranjeira (Araújo et al., 2002).

Os microrganismos endofíticos são aqueles que não causam prejuízos

visuais às plantas, mas que podem ser isolados a partir de tecidos ou partes internas do vegetal, esterelizados superficialmente. Além disso, os endofíticos normalmente colonizam um nicho similar ao dos microrganismos fitopatogênicos, e muitas vezes podem interagir entre si, sendo empregados em mecanismos de controle biológico (Araújo et al., 2002).

Um estudo recente mostrou quais são os principais microrganismos endofíticos presentes em laranjeiras do interior de São Paulo e sul de Minas Gerais. Foram detectadas bactérias dos gêneros Bacillus, Curtobacterium, Enterobacter, Nocardia, Pantoea, Streptomyces, Xanthomonas e várias espécies do gênero Methylobacterium (M. extorquens, M. mesophilicum, M. fujisawaense, M. radiotolerans e M. zatmanii), entre outros. O estudo da variação sazonal desta colonização endofítica mostrou a presença expressiva de espécies do gênero Methylobacterium em plantas sintomáticas infectadas por Xylella fastidiosa principalmente no outono, com decréscimo na primavera (Araújo et al., 2002). Porém, de uma forma geral, as espécies do gênero Methylobacterium apresentaram a maior frequência de isolamento (Figura 11). F re quê nc ia de isolame n to

CVC-sintomático Assintomático Não-Infectado Tangerina

Figura 11. Frequência de isolamento de microrganismos endofíticos de diferentes indivíduos de Citrus sinensis (laranjeiras) no período março-abril

de 1997. Note a grande proporção de Methylobacterium spp. em larajeiras com sintomas da clorose variegada dos citros (CVC-sintomático). Referência:

As bactérias do gênero Methylobacterium são capazes de fixar nitrogênio atmosférico e podem sobreviver utilizando metanol como única fonte de carbono. Elas são encontradas nos mais diversos ambientes como solo, rizosfera e água; porém, são frequentemente encontradas associadas a plantas em relações simbiontes, onde contribuem produzindo diversos fitormônios como ácido indolacético, citocinas e vitamina B12 e em contrapartida recebem o metanol produzido pelas plantas como fonte de carbono (Penalver et al., 2006).

Verificou-se que a ocorrência de espécies do gênero Methylobacterium em citros têm uma correlação estreita com a ocorrência e severidade dos sintomas da doença da clorose variegada causada por Xylella fastidiosa; ou seja, altas densidades populacionais de Methylobacterium foram encontradas em exemplares severamente atacados pela clorose variegada dos citros, prevalecendo sobre outras bactérias, principalmente as Gram-positivas (Araújo et al., 2002).

Num trabalho recente, Poonguzhali e colaboradores (2007) realizaram ensaios com biorepórteres visando encontrar evidências da produção de acil- homosserina lactonas por diversas espécies do gênero Methylobacterium provenientes de diferemtes fontes, como água potável, solo, como endofíticos do arroz ou da rizosfera. Das 18 cepas estudadas, 12 induziram a síntese de β- galactosidase na cepa mutante Agrobacterium tumefaciens (traR, tra::lacZ749). Entretanto, nenhuma cepa estimulou a síntese do antibiótico violaceína com o biossensor Chromobacterium violaceum CV026. Trata-se de um resultado interessante, uma vez que a cepa CV026 é capaz de detectar apenas acil-homosserina lactonas de cadeia acila curtas (butanoil e hexanoil), sugerindo que as espécies do gênero Methylobacterium devam produzir substâncias sinalizadoras de cadeia longa.

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Figura 12. Acil-homosserina lactonas produzidas por Methylobacterium extorquens AM1 (Penalver et al., 2006).

Atualmente, M. extorquens AM1 é a única espécie do gênero estudada

detalhadamente quanto à produção de acil-homosserina lactonas (Penalver et al., 2006). Interessantemente, esta cepa produz acil-HSLs de cadeia longa (tetradecanoil) em condições metanotróficas de crescimento, com um padrão de insaturações inédito na literatura, a N-(2E, 7Z)-tetradecadienil-HSL (Figura 12), entre outras. Por outro lado, quando o metanol é substituído por succinato como fonte de carbono, acil-HSLs de cadeia curta (N-hexanoil e N-octanoil- HSL) são produzidas. A mistura de ambas fontes de carbono leva à produção de acil-HSLs de cadeias curtas e longas, mostrando claramente uma mudança no padrão de expressão destes metabólitos dependendo da fonte de carbono disponível. Posteriormente, descobriu-se que estas substâncias são responsáveis pela regulação da síntese de exopolissacarídeos, fatores

importantes na constituição de biofilmes pelas bactérias (Penalver et al., 2006).

Em conjunto, todos estes dados nos fizeram levantar a hipótese que M. mesophilicum isolada da laranjeira produza acil-homosserina lactonas. Dados os estudos recentes mostrando a importância destes metabólitos como agentes antimicrobianos contra bactérias Gram-positivas (além de substâncias sinalizadoras), isto estimulou nosso grupo de pesquisas a consolidar uma já produtiva parceria com o Prof. Dr. Welington Luíz de Araújo da ESALQ (Piracicaba, São Paulo) para estudar a produção de acil-homosserina lactonas por M. mesophilicum e os possíveis efeitos destas substâncias sinalizadoras

2. Objetivos

Os principais objetivos deste trabalho são:

1) Determinar a configuração absoluta da (S)-N-heptanoil-homosserina lactona produzida por Pantoea ananatis.

2) Avaliar a importância da configuração absoluta para atividade antimicrobiana de acil-homosserina lactonas contra bactérias Gram- positivas.

3) Estudar a interação da (S)-N-3-oxo-octanoil-HSL com lipossomas e células íntegras de Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4).

3) Realizar estudo químico das substâncias sinalizadoras produzidas pela bactéria Methylobacterium mesophilicum incluindo variações em meios de cultura, sínteses, determinações de configuração absoluta e ensaios com cepa biosensora. Avaliar as atividades antimicrobianas das substâncias sintetizadas contra bactérias Gram-positivas endofíticas da laranja.

5) Caracterizar quimicamente a secreção de defesa do opilião Hoplobunus mexicanus (Arachnida: Opiliones), contribuindo para elucidar seu repertório de defesa.