INTERACTION WITH THE ENVIRONMENT

PADG_01626 Iron donor protein CyaY 1641.42 2.0751

PADG_04175 Inorganic pyrophosphatase 7349.82 1.6989 14.UNCLASSIFIED

PADG_03654 Conserved hypothetical protein 1311.10 2.0959

PADG_00694 Ankyrin repeat protein 2060.09 *

PADG_03203 BAR domain protein 6000.61 2.1815

PADG_03031 CobW domain containing protein 1570.29 *

PADG_02092 Conserved hypothetical protein 2811.28 2.6645

PADG_02388 Conserved hypothetical protein 814.41 *

PADG_03210 Conserved hypothetical protein 2560.42 *

PADG_00211 Conserved hypothetical protein 3818.61 1.5841

PADG_00676 Conserved hypothetical protein 2527.06 1.5068

PADG_02338 Conserved hypothetical protein 16993.36 1.5373

PADG_02343 Conserved hypothetical protein 2221.02 1.8040

PADG_02759 Conserved hypothetical protein 14743.00 1.9937

PADG_05534 Conserved hypothetical protein 1888.07 *

PADG_06080 Conserved hypothetical protein 1930.18 *

PADG_06861 Conserved hypothetical protein 1868.86 *

PADG_07670 Conserved hypothetical protein 8042.98 1.8965

PADG_12447 Conserved hypothetical protein 2643.13 2.8292

PADG_03684 Conserved hypothetical protein 1376.16 *

PADG_08034 Dienelactone hydrolase family protein 4687.69 1.6989

PADG_03115 Hypothetical protein 5399.23 1.5068

PADG_00921 Hypothetical protein 8906.26 1.6323

PADG_02967 Hypothetical protein 4183.88 1.7683

PADG_05110 Hypothetical protein 1493.14 *

PADG_03039 Hypothetical protein 999.94 *

PADG_01010 Predicted protein 3288.18 3.5966

PADG_03559 Predicted protein 3270.91 *

PADG_08270 UBX protein domain 1048.72 2.4109

a Identification of differentially regulated proteins from Paracoccidioides genome database (http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiHome.html) using the ProteinLynx Global Server vs. 2.4 (PLGS) (Waters Corporation, Manchester, UK).

b Genes annotation from Paracoccidioides genome database or by homology from NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

c Infection/Control means: The level of expression in yeast cells derived from infected lung divided by the level in the control yeast cells.

d Biological process of differentially expressed proteins from MIPS (http://mips.helmholtz-muenchen.de/funcatDB ) and Uniprot databases (http://www.uniprot.org/).

*: identified only in infection.

121 Neste estudo, utilizamos análises transcricionais, proteômicas e de bioinformática para identificar e caracterizar a expressão gênica em P. brasiliensis durante a infecção pulmonar. As estratégias proteômicas e transcricionais foram projetadas para capturar a resposta fúngica no início do processo de infecção. Estudos focados em interações patógeno-hospedeiro a nível molecular têm sido tradicionalmente desafiadores devido ao número limitado de métodos confiáveis para a coleta de células fúngicas de órgãos infectados. Aqui, descrevemos um método direto para a recuperação de células de levedura de P. brasiliensis durante os estágios iniciais da infecção pulmonar para análises transcricionais e proteômicas in vivo.

Além disso, integramos dados transcricionais e proteômicos para avaliar como o P.

brasiliensis se adapta ao hospedeiro durante os estágios iniciais da infecção no pulmão do camundongo. As alterações nos perfis de proteínas apresentaram baixa congruência com os níveis de transcritos. Atribuímos esse fato aos processos pós-transcricionais desempenhando um papel crítico nos níveis de proteína, como descrito em Aspergillus flavus (Bai et al, 2015). Embora tenhamos empregado um fold change de 2 vezes na análise transcricional, a presença de excesso de RNAs hospedeiros nas amostras poderia impacto nos resultados.

As respostas adaptativas dentro de 6 h de infecção incluem inibição do metabolismo da parede celular e aumento das vias ligadas a respostas protetoras contra espécies reativas de oxigênio, bem como remodelação do metabolismo para a degradação lipídica, produção de etanol e ciclo de glioxalato. Além disso, uma serina proteinase, potencialmente ligada à patogênese, foi caracterizada.

A análise dos dados identificou 1761 transcritos com aproximadamente 34%

(594 genes) diferencialmente expressos (164 regulados positivamente, 430 com

122 para baixo in vivo demonstrou um forte efeito no metabolismo da parede celular. Um padrão impressionante foi a repressão de vários genes envolvidos com a biossíntese de glicana, quitina e genes que ativam a quitina sintase. Além disso, as glicosil hidrolases e os genes responsivos ao metabolismo da quitina foram reprimidos. A parede celular é dinâmica e responde a mudanças no ambiente externo. Múltiplas funções celulares, incluindo o remodelamento da parede celular, reguladas negativamente pelo fator de transcrição Zcf21, contribuem para a capacidade de C.

albicans em promover a infecção sistêmica (Hall et al, 2015; Böhm et al, 2016). Os mutantes Zcf21 têm maior conteúdo de polissacarídeos de parede celular, aumento da suscetibilidade à fagocitose e prejudicando a sobrevivência intracelular em macrófagos (Böhm et al, 2016). Ainda necessita ser elucidado se a inibição dos genes da parede celular em P. brasiliensis pode influenciar o reconhecimento do hospedeiro.

Identificamos 350 proteínas diferencialmente expressas in vivo (203 reguladas induzidas, 147 reprimidas). Entre as proteínas reguladas, foi encontrado um arsenal de enzimas de defesa a ROS (Espécies Reativas de Oxigênio). As células fagocíticas hospedeiras usam espécies reativas de oxigênio como parte de sua defesa para neutralizar microorganismos invasores (Fang, 2004). As células fagocíticas do sistema imune inato produzem vários oxidantes que se presume desempenhar papéis na morte microbiana. Estudos proteômicos, durante o tratamento de Paracoccidioides sp. com peróxido de hidrogênio, descreveu a elevação da regulação das enzimas de desintoxicação ROS. Estas enzimas incluem catalases, superóxido dismutases, citocromo c peroxidase e tiorredoxina (de Arruda Grossklaus et al, 2013). Análise dos mecanismos de desintoxicação de P. brasiliensis às 6 h pós-infecção do pulmão de camundongo, apoiam fortemente o conceito de que o fungo está exposto a um estresse

123 tiorredoxinas e tiorredoxinas redutases são induzidas. A análise histopatológica demonstrou que as células polimorfonucleares estavam em contato direto com células de levedura de P. brasiliensis, o que poderia explicar a resposta fúngica ao estresse oxidativo. De acordo com estudos in vitro, proteínas como a tiorredoxina e superóxido dismutases de Cu / Zn, acumuladas em células de levedura de P. brasiliensis infectando macrófagos (Parente-Rocha et al, 2015). Enzimas relacionadas à desintoxicação, como superóxido dismutases, SOD1 (PADG_07418) e SOD2 (PADG_01755) também foram acumulado em leveduras de P. brasiliensis após 6 h de infecção. Os mutantes knockdown para SOD1, apesar de poderem infectar o pulmão de camundongo, foram incapazes de se disseminar para outros órgãos, sugerindo seu envolvimento na atividade intracelular do fungo (Tamayo et al, 2016).

Foram induzidas a níveis proteômicos a citocromo c peroxidade (PADG_03163) e as tiorretoxinas (PADG_03161, PADG_05504 e PADG_01551). Estudos anteriores descreveram uma possível relação entre a desintoxicação e a virulência da ROS. A citocromo c peroxidase (CCP) é um potencial fator de virulência, como demonstrado em estudos usando o mutante silenciado para este gene. O silenciamento do CCP reduz a sobrevivência de P. brasiliensis durante a infecção por macrófagos e nas células de levedura submetidas a estresse nitrosativo in vitro (Parente et al, 2015;

Parente-Rocha et al, 2015). Para manter a homeostase redox celular, as células de levedura podem proporcionar potencial redução para a maioria das enzimas reguladoras e antioxidantes (Krüger et al, 2011; Ralser et al, 2009). Desta forma, a ativação da via do fosfato de pentose, que é uma fonte de poder de redução celular sob a forma de NADPH, reforça o conceito de que as células de levedura de P.

124 dos radicais livres depende em grande parte do NADPH.

As mudanças na disponibilidade de nutrientes no início do processo de infecção poderiam desempenhar um papel na repressão dos genes glicolíticos e na regulação do ciclo do glioxalato. Paracoccidioides sp. co-cultivada com macrófagos murinos regulou as transcrições para as enzimas específicas do ciclo de glioxalato (isocitrato liase e malate sintase), sugeridas por análises de RT-PCR (Derengowski et al, 2008).

Em contraste, nas células de levedura de P. brasiliensis cultivadas com macrófagos (Parente-Rocha et al, 2015), a gluconeogênese não parece desempenhar um papel importante durante a infecção pulmonar, uma vez que os genes que codificam enzimas chave, bem como proteínas cognatas nesta via, não foram regulados de acordo com a análise do proteoma. Esta constatação está de acordo com nossos resultados. O estágio e o local da infecção podem influenciar o metabolismo. Estudos sobre mutantes de C.

albicans em várias vias metabólicas de carbono demonstraram que o ciclo de glioxalato e a gliconeogênese eram essenciais para a sobrevivência de fungos durante interações iniciais com células imunes do hospedeiro. Mais tarde, à medida que as células de levedura colonizam, alteraram o metabolismo do carbono de não fermentativo para fermentativo (isto é, glicólise) (Barelle et al, 2006). De forma semelhante, a pesquisa em C. neoformans demonstrou que a deleção de genes de piruvato quinase (PYK1) e hexoquinases (HXK1, HXK2) envolvido com a glicólise, resultou em insuficiência de sobrevivência fúngica no fluido cérebro-espinhal de coelhos, ao mesmo tempo que mostrava persistência nos pulmões de camundongos.

C. neoformans necessitou de gluconeogênese quando reside no pulmão, uma vez que a deleção de fosfoenolpiruvato carboxiquinase (o mutante pck1Δ) resultou em virulência atenuada em um modelo de inalação murinho (Price et al, 2011). As células

125 ambiente pobre em carboidratos, o que é sugerido pelo acúmulo aumentado de isocitrato liase. A ativação do ciclo do glioxalato pode compensar a falta de carboidratos no meio, como demonstrado para C. albicans após a fagocitose por macrófagos (Lorenz e Fink, 2001).

P. brasiliensis provavelmente usa múltiplas fontes de carbono, incluindo lipídios, aminoácidos e etanol durante a infecção. Após 6 horas de infecção, as células aumentaram os genes e as proteínas envolvidas com o catabolismo lipídico (por exemplo, β-oxidação). Da mesma forma, a análise proteômica de P. brasiliensis durante a infecção por macrófagos sugeriu que as células de levedura usam ácidos graxos para sobreviver dentro dos fagócitos (Parente-Rocha et al, 2015). No contexto da adaptação metabólica ao hospedeiro, também observamos um aumento na desidrogenase alcoólica e na piruvato descarboxilase. O piruvato é provavelmente fornecido pela degradação de aminoácidos. Estudos transcricionais de Paracoccidioides sp. as células de levedura recuperadas do fígado de rato sugeriram que o etanol é produzido durante a infecção (Costa et al, 2007). Da mesma forma, conseguimos confirmar a produção de etanol por células de levedura de P. brasiliensis durante a infecção pulmonar. O transcritoma e as análises enzimáticas de Aspergillus fumigatus demonstraram que este fungo produz etanol sob condições hipóxicas (Barker et al, 2012; Grahl et al, 2011). As cepas de A. fumigatus deficientes em etanol promoveram um aumento da resposta inflamatória em camundongos infectados que correspondeu a uma redução na carga fúngica (Grahl et al, 2011).

Durante a infecção pulmonar, a produção e secreção de uma serina proteinase foi induzida em células de levedura de P. brasiliensis. Experimentos imunohistoquímicos demonstraram que esta proteína está localizada

126 hospedeiro murino, após a indução de resposta inflamatória por zymozan, carragenina e células fúngicas mortas por calor. Os resultados demonstraram claramente que os anticorpos policlonais não reagem com proteases das células hospedeiras. Além disso, anticorpos policlonais contra esta proteína reduziram a carga fúngica de animais infectados. Existe potencial que esta serino protease possa funcionar como um fator de virulência. Em Mycobacterium tuberculosis, um homólogo de serino proteinase, mycosin-1, é secretado e contribui para a virulência durante a infecção aguda (Dave et al, 2002). Potenciais fatores de virulência adicionais podem ser inferidos a partir de nossos dados. Os dados do transcritoma descreveram a indução do gene Laccase IV (PADG_05994), que pode estar relacionado ao aumento da virulência fúngica. Os fungos patogênicos, como Paracoccidioides spp., C. neoformans, H. capsulatum e C.

albicans produzem DOPA-melanina via laccase. A melanização parece contribuir para a virulência, reduzindo a susceptibilidade de fungos melanizados para hospedar mecanismos de defesa e antifúngicos (Taborda et al, 2008).

127 Em conclusão, propomos que P. brasiliensis, nos estágios iniciais da infecção pulmonar murina, promove o remodelamento do seu metabolismo de carbono, utilizando preferencialmente lipídios, para sobreviver ao ambiente hostil do hospedeiro. Além disso, a síntese dos principais componentes da parede celular pode ser reprimida, habilitando o fungo a montar uma conformação de parede celular adequada para colonizar o hospedeiro e escapar do sistema imune do hospedeiro. De especial atenção, uma serino proteinase induzida é secretada no tecido pulmonar murino após 6 h de infecção, provavelmente permitindo que o fungo entre e invada o tecido pulmonar. Para o nosso conhecimento, até saber, este é o primeiro relatório de dados transcricionais e proteômicos de P. brasiliensis após infecção do hospedeiro.

Acreditamos que esta pesquisa fornece uma estratégia bem sucedida para a recuperação de células de levedura de P. brasiliensis de pulmão infectado e abre novas perspectivas no estudo da interação fungo-hospedeiro. Além disso, esta pesquisa fornece um arsenal de moléculas que são expressas in vivo que podem ser relevantes para a interação fungo-hospedeiro. Este estudo abre novas perspectivas no estudo da interação fungo-hospedeiro. Experimentos futuros focados na cinética da infecção serão realizados para estabelecer a adaptação do fungo metabólico ao hospedeiro em diferentes tempos de infecção.

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No documento LAURINE LACERDA PIGOSSO (páginas 118-137)