Interface da quimera 209

As estruturas que obtiveram os maiores scores foram: 4077, 4146, 1090, 2806 e 463 (os valores da função foram 0,953; 0,946; 0,940; 0,939; e 0,938 respectivamente). Em cada simulação a estrutura foi inicialmente submetida a uma minimização utilizando o algoritmo Steepest Descent (Arfken, 1985). A proteína foi então solvatada com moléculas de água SPC, numa caixa dodecaédrica, até que a concentração de aproximadamente 55 mol/L fosse atingida. Três íons sódio foram adicionados para atingir a neutralidade do sistema. A equilibração foi realizada a 300 K em duas etapas: a primeira totalizando 100 ps, com passo 0,001 ps, mantendo a proteína rígida e deixando apenas as águas se movimentarem; na segunda, tirou-se a restrição sobre a proteína e o sistema foi equilibrado por mais 200 ps, com passo 0,002 ps. A fase de cálculo da simulação foi realizada a 300 K e pH 7.0 no ensemble NVT, com a temperatura sendo controlada pelo termostato V-rescale. O LINCS foi utilizado para restringir as ligações

covalentes envolvendo os átomos de hidrogênio da proteína, enquanto o SETTLE restringiu as ligações covalentes das moléculas de água. O algoritmo para integração das equações de movimento utilizado foi o Leap-Frog com passo de 0,002 ps. Os procedimentos aqui descritos, bem como os parâmetros e algoritmos usados, foram utilizados nas simulações para as quimeras 262 e 271.

A Figura 5.19 mostra a evolução da energia de interação entre domínios para cada uma das 5 simulações. A análise da energia interfacial a partir das trajetórias apontou que a estrutura 4077 apresenta a interface de menor energia. Para verificar se as trajetórias amostraram eficientemente o espaço conformacional da proteína, calculou-se a projeção de cada uma das 5 trajetórias sobre os dois primeiros componentes principais calculados com o ensemble do CONCOORD. A Figuras 5.20 e 5.21 apresentam o RMSD em função do tempo e as projeções sobre os PC1 e PC2, respectivamente. Pode-se verificar que as conformações preditas pelo CONCOORD alcançam uma variação bem maior que em relação as conformações obtidas pela dinâmica, que costumam ficar restritas a uma pequena região. A exceção foi a trajetória 4146 (cor verde), que se espalhou bem no espaço determinado pelos PC1 e PC2 e que apresentou a interface de mais alta energia. Observando as Figuras 5.20 e 5.21 é possível afirmar que esta estrutura sofreu amplas variações estruturais ao longo da simulação. De fato, as outras quatro trajetórias juntas não se espalham tanto quanto a trajetória 4146 na Figura 5.21. É sugerido, para trabalhos futuros, que ao invés de utilizar a função score para selecionar estruturas que serão submetidas a simulações DM, utilize-se o gráfico de projeção sobre os dois primeiros PC’s, pois eles indicarão estruturas que estão suficientemente afastadas em termos de conformação, no que se refere a suas projeções sobre os componentes principais selecionados para plotar o gráfico.

Figura 5.19 – Energia potencial de interação entre os domínios XBP-xilanase para cada uma

das 5 simulações para a quimera 209.

Fonte: Autor

Figura 5.20 – Raiz quadrada do desvio quadrático médio das posições dos átomos

“backbone” em função do tempo.

Figura 5.21 – Projeção sobre os dois primeiros componentes principais (quimera 209).

Fonte: Autor

Para identificar resíduos que têm contribuição importante para a estabilização da interface, calculou-se para cada resíduo da XBP a sua energia de interação com o domínio da xilanase, e para os resíduos da xilanase sua energia de interação com o domínio da XBP, para as três quimeras. Os valores médios de energia calculados ao longo da trajetória de 10 ns foram plotados em um gráfico de barras para cada uma das simulações, mostrando apenas os resíduos da xilanase (Figura 5.22). O raio de corte considerado para as interações de átomos não ligados foi 8.0 Å, ou seja, foram calculadas as interações existentes dentro de uma esfera de 8.0 Å centrada no resíduo de interesse. Considerou-se como critério para definir os resíduos interfaciais uma energia de interação inferior a -1 kcal/mol do resíduo com o domínio oposto. A trajetória 4146, como já comentado anteriormente, foi a que formou a interface menos estável, logo os resíduos interfaciais são os que interagem mais fracamente (Figura 5.22b). O resíduo Asp312, da trajetória 4077 (Figura 5.22e) destaca-se pela interação altamente atrativa, aproximadamente -24 kcal/mol, não observada nas demais trajetórias, estando ausente na 4146. De acordo com o critério de -1 kcal/mol para interface, a Tabela 5.2 mostra os resíduos interfaciais presentes em cada uma das trajetórias.

Figura 5.22 – Resíduos interfaciais da quimera 209; (a) trajetória 4077; (b) trajetória 4146;

(c) trajetória 1090; (d) trajetória 463; (e) trajetória 2806.

Fonte: Autor

Tabela 5.2 – Resíduos interfaciais para cada uma das cinco trajetórias produzidas por

simulação de DM para a 209. XBP Xilanase Trajetória 4077 179, 183, 186, 187, 188, 189, 209, 403, 404, 405 212, 213, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 263, 312, 356, 375, 396 Trajetória 4146 179, 186, 187, 188, 403, 404, 405 212, 213, 256, 257, 259, 260 Trajetória 1090 179, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 207, 209, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406 212, 213, 253, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 312, 356, 358, 373, 374, 375

Trajetória 463 176, 179, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 209, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406 212, 213, 215, 253, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 312, 356, 358, 375 Trajetória 2806 179, 182, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 207, 209, 402, 403, 404, 405, 406 212, 213, 215, 253, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 312, 356, 358, 373, 375 Fonte: Autor

Para esclarecer melhor a interação do resíduo Asp312 com a XBP, a Figura 5.23 apresenta a energia potencial de interação desse resíduo com a XBP em função do tempo. Observa-se que a interação do Asp312, nessa faixa de energia, é formada durante a simulação, entre 2 e 8ns. A Figura 5.24 apresenta a estrutura coletada no tempo 5ns. O resíduo de Lys405 da XBP apresenta-se como o mais próximo do Asp312, a distância entre os dois oxigênios carbonílicos do Asp312 e o grupo metil da Lys405 é de aproximadamente 2,0 Å. Trata-se de uma interação de alta intensidade que não é estável nas condições da simulação, dado que foi detectada em apenas uma delas e não permaneceu por toda a simulação.

Figura 5.23 – Energia de interação entre os resíduos Asp312 e Lys405 ao longo da simulação

na quimera 209, trajetória 4077.

Fonte: Autor

Figura 5.24 – Estrutura da quimera 209, trajetória 4077, correspondente a t=5,0ns, ilustrando

Fonte: Autor

Na Figura 5.25 estão destacados na quimera 209 todos os resíduos que contribuíram para interface, de acordo com o observado na Tabela 5.1. Em vermelho estão os resíduos da XBP, em azul os da Xilanase, e em amarelo estão e apresentaram baixa ocorrência nas simulações. A presença esporádica de resíduos na interface mostra que há certa flexibilidade da proteína para alterar a interface formada entre os domínios. Faz-se notar que nem sempre resíduos contíguos participam de interações interdomínios com a mesma intensidade. Isso porque não apenas a posição na sequência de aminoácidos é importante, mas também se a posição da cadeia lateral está ou não direcionada para favorecer a interação.

Figura 5.25 – Resíduos interfaciais da quimera 209. A estrutura utilizada é apenas para fins

de visualização, não correspondendo a uma conformação obtida das simulações. Em vermelho estão os resíduos interfaciais da XBP; em azul estão os resíduos interfaciais da xilanase para a

quimera 209 e em amarelo estão os resíduos intermitentes.

Fonte: Autor