O intervalo de confiança (IC) do QTL foi obtido na opção “Bootstrap with resampling” do programa QTL EXPRESS, que usa esse método para calcular o IC empírico (95%) da posição do QTL.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Extração de DNA
Na fase inicial do projeto foram testados vários protocolos de extração de DNA para escolha de um método rápido, devido ao grande número de amostras, e que possibilitasse a obtenção de DNA de boa qualidade e em quantidade suficiente. O protocolo de Hillel et al. (1989) (Anexo A) mostrou-se inadequado por ser demorado e consumir grandes quantidades de reagentes. O protocolo de Hillel modificado (Anexo B), apesar de utilizar menores quantidades de reagentes e ser mais rápido que o anterior, não resultou em DNA de boa qualidade. Optou-se então por testar o
DNAzol®, sendo necessária uma alteração (Anexo C) no protocolo recomendado pelo
fabricante (Anexo D). O protocolo DNAzol® modificado (Anexo C) foi utilizado para a extração de DNA, sendo de modo geral eficiente, tanto pela qualidade do DNA extraído quanto pela rapidez do método. Para amostras que apresentaram problemas na extração com DNAzol ®, cerca de 10%, resultando em DNA difícil de ser ressuspendido ou com baixa concentração (menos de 20ng/µL), foi utilizada a extração com proteinase K (Anexo E).
Após a extração, todas a amostras tiveram sua concentração determinada por espectrofotometria e ajustada para 20 ng/µL. As amostras padronizadas foram aplicas em gel de agarose (1,0%) para verificação da qualidade do DNA, conforme pode ser observado nas Figuras 2 e 3.
Figura 2 - Amostras de DNA extraídas e aplicadas em gel de agarose (1,0%) sob eletroforese. Nas primeiras e últimas canaletas foi aplicado como padrão de concentração o plasmídeo pGEN4Z nas concentrações de 100 e 200 ng, respectivamente
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Figura 3 - Gel de agarose 1,0% contendo DNA dos animais padronizado para concentração de 20ng/µL, de acordo com as leituras do espectrofotômetro. Nas primeiras e últimas canaletas foi aplicado como padrão de concentração o plasmídeo pGEN4Z nas concentrações de 100 e 200 ng, respectivamente
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Amostras que foram novamente diluídas utilizando o dobro de DNA e monitoradas nas amplificações dos marcadores.Na Figura 3 estão indicadas com asteriscos as amostras que, apesar de quantificadas em espectrofotômetro e diluídas para 20ng/µL, estavam com a concentração bem abaixo do estipulado. Para estas amostras o DNA original foi novamente diluído para uma concentração maior (40 ng/µL). Estas amostras foram monitoradas durante as amplificações, sendo aplicadas juntamente com outras amostras em agarose e submetidas à eletroforese para cada marcador amplificado, antes de serem genotipadas no seqüenciador.
4.2 Amplificação por PCR
Dos 80 marcadores testados 10 marcadores nunca produziram produtos de PCR (LEI194, LEI252, LEI193, ADL314, MCW289, MCW101, LEI198, ADL37, MCW36, GCT05), mesmo após algumas alterações na temperatura de anelamento e concentração de Mg++ para melhorar a especificidade dos primers e a atividade e fidelidade da enzima.
Na otimização das condições de PCR existem várias alterações a serem testadas que demandam tempo, sendo mais interessante utilizar outros iniciadores nestas regiões sempre que possível. Este tipo de problema também foi encontrado por Zhu et al. (2001), que em seus estudos testaram diferentes temperaturas de anelamento e concentrações de Mg++, mas cerca de dois terços dos iniciadores não produziram produtos de PCR; os autores também optaram por abandoná-los e substituí-los.
As quantidades de MgCl2 utilizadas neste estudo foram superiores às
recomendadas no site www.genome.iastate.edu. Entretanto, tentativas de redução na quantidade de Mg++, na maioria das vezes, comprometeu o resultado da amplificação. A redução na quantidade de Mg++, com o objetivo de aumentar a especificidade dos iniciadores, surtiu menores efeitos quando comparado com o ajuste da temperatura de anelamento.
Outra possível explicação para alguns iniciadores não produzirem produto de PCR foi o longo tempo de estocagem. Alguns destes iniciadores foram sintetizados em 1998 e os testes deste estudo foram iniciados em 2000. Apesar disso, a maioria
(87,5%) dos iniciadores apresentaram amplificação satisfatória após a otimização das condições de PCR.
As figuras 4, 5, 6 e 7 são imagens de géis de agarose 2,0%, onde foram aplicados produtos de PCR da fase de otimização das condições de amplificação de alguns iniciadores.
ADL101 ADL238 ADL251 ADL19
Figura 4 - Gel de agarose 2,0% com testes das condições de amplificação. Apenas o marcador ADL 19 foi otimizado. Os demais marcadores apresentaram bandas inespecíficas, sendo necessários ajustes nas condições de PCR. Na primeira canaleta foi aplicado o padrão øX174 RF DNA/Hae III
ADL19 ADL238 MCW145 ADL101
Figura 5 - Gel apresentando testes das condições de amplificação. Todos os marcadores foram otimizados apresentando apenas as bandas nos tamanhos esperados. Na primeira canaleta foi aplicado o padrão øX174 RF DNA/Hae III
HUJ01 ADL234 LEI101
Figura 6 - Gel com testes das condições de amplificação. O marcador HUJ 01 apresentou amplificação específica e os demais marcadores necessitaram de alterações nas condições de amplificação, pois apresentaram bandas inespecíficas. Na primeira canaleta foi aplicado o padrão øX174 RF DNA/Hae III
ADL234 ABR328
Figura 7 - Gel onde são apresentados o marcador ADL 234 com amplificação não específica e o marcador ABR 328 otimizado (apresentando banda específica de tamanho esperado). Na primeira canaleta foi aplicado o padrão øX174 RF DNA/Hae III
Nas figuras 8, 9, 10, 11 e 12 são apresentados géis onde são testadas várias amostras de cada marcador, tentando com isso evitar falhas na genotipagem, ocasionadas por má qualidade de produto amplificado. Para cada amplificação foi verificado o tamanho do fragmento esperado e a presença de bandas inespecíficas. A identificação de bandas inespecíficas foi importante para que, no momento da montagem das placas de genotipagem, quando foi preparada uma mistura do produto amplificado de 3 a 4 marcadores, se tivesse o cuidado de agrupar as amplificações inespecíficas somente com amplificações de marcadores com outro tipo de fluorescência. Esse cuidado foi importante para não comprometer a genotipagem de nenhum dos marcadores e evitar o descarte das amplificações que apresentassem bandas inespecíficas.
Figura 8 - Gel de agarose 2,0% com material amplificado dos marcadores LEI 79 e MCW 218. Na primeira canaleta foi aplicado o padrão øX174 RF DNA/Hae III
LEI79 – 200 a 234 pb
MCW218 – 258 a 282 pb
LEI106 – 288 a 300 pb
Figura 9 - Gel de agarose 2,0% com material amplificado do marcador LEI106. Na primeira canaleta foi aplicado o padrão øX174 RF DNA/Hae III
LEI91 – 238 a 264 pb
Figura 10 - Gel de agarose 2,0% com material amplificado do marcador LEI91. Na primeira canaleta foi aplicado o padrão øX174 RF DNA/Hae III
MCW145 – 170 a 210 pb ADL19 – 84 a 124 pb
Figura 11 - Gel de agarose 2,0% com material amplificado dos marcadores ADL19 e MCW145. Na primeira canaleta foi aplicado o padrão øX174 RF DNA/Hae III
LEI134 – 294 a 300 pb
MCW107 - 90 a 130 pb
Figura 12 - Gel de agarose 2,0% com material amplificado dos marcadores LEI134 e MCW107. Na primeira canaleta foi aplicado o padrão øX174 RF DNA/Hae III