O vigor das sementes é uma característica complexa e essencial para a produtividade. O uso de sementes de baixa qualidade ou manejo inadequado pode afetar negativamente a germinação, dificultar a emergência das plântulas, produzir falhas no estande, desuniformidade e redução na quantidade e qualidade da produção (BORTOLOTTO et al., 2008). O vigor das sementes é determinado durante o seu desenvolvimento. No decorrer desta fase um grande número de nutrientes são gradativamente acumulados e mudanças morfológicas e fisiológicas são iniciadas e visualizadas (CAO et al., 2008).
Diferenças no vigor associadas com as características das sementes são geralmente atribuídas à sua composição, principalmente com relação à quantidade de reservas ou a eficiência no metabolismo (HAMPTON, 1973). Quanto maior o teor de reservas das sementes, maior será o vigor das plântulas originadas, e maior será o seu potencial de armazenamento. O suprimento de água durante o período de desenvolvimento da semente pode influenciar indiretamente seu vigor pelo efeito que exerce sobre sua composição química (CARVALHO e NAKAGAWA, 2000). Sementes de alta qualidade possuem um eficiente metabolismo, com mecanismos que combatem a deterioração, com respostas antioxidantes e de reparo de DNA que mantém a qualidade das sementes (VENTURA et al., 2012) até o desencadeamento do processo germinativo, com a utilização das reservas acumuladas. Durante o processo germinativo, as diferentes
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reservas são mobilizadas por diferentes via metabólicas, e a mesma reserva pode estar sujeita a diferentes vias de degradação, dependendo da espécie (HAN, et al., 2013).
Existe uma série de fatores que podem afetar a composição das reservas: características genéticas, cultivar, estádio de maturação, fertilidade do solo e condições climáticas, supõem-se que as práticas de manejo que alteram a produtividade possam também alterar a remobilização de nutrientes de diferentes partes da planta para as sementes (PEREIRA, 2009). Para Hiroce et al. (1989), existem diferenças genéticas na absorção de nutrientes e na eficiência de conversão dos elementos assimilados em produção de grãos de milho. O mesmo ocorre na síntese de acúmulo dos principais componentes de reserva das sementes. Estas diferenças são importantes para o melhoramento genético e para indicativos de manejo a determinado sistema agrícola. A interação genótipo ambiente também apresenta efeitos diferenciados na eficiência de translocação de nutrientes para as sementes (POLLMER et al., 1979).
Durante a fase de desenvolvimento das sementes ocorre a remobilização, transporte e acúmulo de nutrientes de órgão vegetativos para as sementes que posteriormente serão utilizadas no processo germinativo. Nas sementes, é necessário que o acúmulo de reservas seja feito adequadamente, uma vez que o desenvolvimento inicial das plântulas depende dessas substâncias (VEIGA et al., 2010). A mobilização das reservas inicia a partir de um sinal que vem o embrião. Com isso o processo de degradação dos compostos de reserva tem inicio pela ativação da transcrição de genes que originam as hidrolases, a consequente produção e transporte de enzimas até o local de ação (BEWLEY, 2001).
O teor de proteína total, fosforo total, carboidratos solúveis, amilose, ferro e zinco foram abordados no presente por serem os componentes presentes em maior volume nas sementes e terem funções importantes na retomada do crescimento do embrião, cada um assumindo funções específicas no processo. As proteínas são os componentes básicos de toda a célula viva, podem assumir função estrutural, nutritiva ou enzimática, participado da estrutura dos tecidos, liberando aminoácidos usados como substratos para a respiração e monitorando reações químicas, além de atuarem em mecanismos de transporte, de defesa ou como reguladoras de processos fisiológicos (MARCOS FILHO, 2005). Os carboidratos solúveis servem como substrato da respiração (BEWLEY e BLACK, 1994; CORTE et al.,
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2006) e como componentes estruturais (ZIEGLER, 1995), protegendo a integridade das membranas celulares (CROWE et al., 1984). Os nutrientes minerais, como fósforo (armazenado em forma de ácido fítico), potássio, magnésio, cálcio, ferro, zinco cobre e magnésio, são constituintes e ativadores enzimáticos, apresentam função antioxidante e são responsáveis pelo transporte de elétrons (IWAI et al., 2012; NAIDOO et al., 2012; DORIA et al., 2009; TAKAHASHI et al., 2009; MARENCO E LOPES, 2007;). Existem programas de melhoramento genético que buscam novas cultivares com características industriais e adaptadas a determinadas condições edafoclimáticas (PEREIRA, 2009). No entanto, do ponto de vista nutricional, o melhoramento genético voltado principalmente para o aumento da produtividade e de outras características agronômicas desejáveis, fez com que o milho perdesse valor nutricional, especialmente com diminuição nos teores de proteína e óleo (BUENO et al., 2009). Isso se deve, por exemplo, a correlação negativa existente entre produtividade e percentagem de proteína e óleo (LIMA e BELLAVER, 1999). Davis (2009), em estudo realizado nos Estados Unidos, evidenciou o declínio no teor de alguns nutrientes em frutas e legumes, apontando relação inversa entre aumento no rendimento e a concentração de minerais, ou seja, quando aumenta-se o rendimento dos cultivos perde-se nutrientes importantes como minerais, proteínas, óleos e aminoácidos, importantes também para a alimentação humana.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a contribuição genética para composição química das sementes de genótipos crioulos e de polinização aberta de milho bem como determinar a resposta fisiológica relacionada à composição química das sementes.
3.2. MATERIAL E MÉTODOS
O campo de produção de sementes foi instalado na unidade experimental da Cooperativa Oestebio, de São Miguel do Oeste/SC e as análises fisiológicas foram realizadas no Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC-CCA) e no laboratório de sementes do Centro de Ciências Agroveterinárias da Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC –CAV).
Os 28 tratamentos avaliados foram compostos por: 8 genitores: um hibrido simples convencional (AS1565), quatro variedades de polinização aberta (SCS 155 Catarina, SCS 154 Fortuna, Fundacep 35 e BRS 4150) e três variedades crioulas (Pixurum 05, MPA 01 e SJC
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5886), e, 10 cruzamentos intervarietais que estão descritos na Tabela 1.3. A produtividade e o conhecimento destas variedades pelos camponeses foram critérios que determinaram a escolha destas para compor os cruzamentos.
Tabela 79.3. Cruzamentos intervarietais de milho e seus recíprocos para determinação da contribuição genética para composição química das sementes.
Tratamento Híbrido Intervarietal*
1 Pixurum 05** 2 MPA 01** 3 SCS 155 Catarina** 4 SCS 154 Fortuna** 5 Fundacep 35** 6 AS1565** 7 SJC5886** 8 BRS4150** 9 MPA 01 x Pixurum 05 10 Pixurum 05 x MPA 01 11 MPA 01 x AS1565 12 AS1565 x MPA 01 13 MPA 01 x SJC 5886 14 SJC 5886 x MPA 01 15 Pixurum 05 x SCS 155 Catarina 16 SCS 155 Catarina x Pixurum 05 17 Pixurum 05 x AS1565 18 AS1565 x Pixurum 05 19 Pixurum 05 x SJC 5886 20 SJC 5886 x Pixurum 05 21 Pixurum 05 x BRS 4150 22 BRS 4150 x Pixurum 05 23 Fundacep 35 x SCS 154 Fortuna 24 SCS 154 Fortuna x Fundacep 35 25 Fundacep 35 x AS 1565 26 AS1565 x Fundacep 35 27 AS1565 x SCS 154 Fortuna 28 SCS 154 Fortuna x AS1565
*O nome que aparece primeiro é o genótipo utilizado como parental feminino. ** Parentais.
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O manejo para adubação foi realizado de forma orgânica e convencional, com o uso de cama de aviário, 3.500kg/ha, no momento do plantio e em cobertura aplicou-se nitrogênio na dosagem de 70 kg/ha. Para a obtenção dos genótipos realizou-se polinização controlada, fertilizando-se 20 plantas com pólen oriundo de outros 20 indivíduos. A condução do experimento a campo foi realizada com auxílio de uma equipe técnica qualificada, integrantes da Cooperativa Oestebio, os quais foram parceiros efetivos na condução das atividades no momento da implantação da área experimental até a colheita e beneficiamento das parcelas.
As amostras utilizadas para determinar a composição química das sementes da primeira geração (F1) em relação aos seus genitores foram obtidas no ponto de colheita quando as sementes estavam com umidade de 18%. As espigas foram debulhadas manualmente, as sementes foram secas naturalmente à sombra até atingirem umidade de aproximadamente 13%.
Uma amostra representativa de sementes (em torno de 1 Kg) oriundas de cada genitor e da primeira geração (F1) produzidas a campo foi reduzia em laboratório para obtenção da amostra de trabalho. A amostra de trabalho foi obtida através da passagem das sementes no homogeneizador tipo Gamet até a obtenção de 4 repetições de aproximadamente 250 g e em seguida armazenada em geladeira.
Uma fração de aproximadamente 80 g da amostra de trabalho, foi utilizada para realizar as análises bioquímicas. No momento da avaliação da composição química, as sementes foram retiradas da geladeira e moídas em moinho de facas tipo Willey. A composição química das sementes foi determinada a partir das seguintes análises bioquímicas:
Extração e quantificação de carboidratos solúveis totais: para a extração dos carboidratos solúveis totais das amostras, um grama da amostra moída foi submetida a uma extração tripla por fervura em etanol 80% durante 5 minutos. Os extratos foram centrifugados a 3000 g, a 20°C, por 10 minutos, e filtrados em microfibra de vidro. Da combinação dos três extratos alcoólicos obteve-se a porção correspondente à fração de açúcares solúveis, que foram quantificados através de análise colorimétrica, pelo método fenol-sulfúrico (DUBOIS et al., 1956), tendo D-glucose como padrão. Para o procedimento, alíquotas das amostras foram adicionadas a 0,5 mL de fenol 5% e 2,5 mL de ácido sulfúrico, sendo completadas com água destilada para 3,5 mL, com posterior leitura da absorbância das amostras em
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espectrofotômetro na faixa de 490 nm. As análises foram realizadas a partir de três repetições biológicas. A extração do amido foi realizada pelo método proposto por McCready et al (1950). Apesar de efetuada a extração, não foi possível efetuar a quantificação das alíquotas em tempo hábil para inclusão nesta dissertação. O amido é importante componente de reserva nas sementes, a sua quantificação é importante e deve ser realizada em trabalhos que avaliem a resposta fisiológica à composição química. Esta relação não será efetuada neste trabalho.
Determinação da amilose: realizada através do método colorimétrico proposto por Williams et al (1970). Foram tomadas 20mg de amido de cada tratamento, acrescentou-se 10mL de hidróxido de potássio 0,5N e transferiu-se para uma balão volumétrico de 100mL e ajustou-se o volume com água destilada, posteriormente tomou-se uma alíquota de 10mL desta solução e transferiu-se para um balão de 50mL, adicionou-se 5mL de ácido clorídrico 0,1N e 0,5mL de solução de iodo, completou-se o balão com água destilada e após 5 minutos efetuou-se a leitura da absorbância das amostras em espectrofotômetro na faixa de 625 nm. As análises foram realizadas a partir de três repetições biológicas. A determinação do teor de amilose foi feito usando curva padrão externa, com uma solução de amilose e amilopectina de milho nas proporções (0:18, 2:16, 4:14, 6:12 e 8:10 mg, m/m, respectivamente).
Teor de proteína total: realizada através da digestão sulfúrica. O procedimento iniciou com a pesagem de 200 mg de grão moído, posteriormente a amostra foi colocada em tubos de digestão (25 x 250 mm), onde se adicionou 2 mL de ácido sulfúrico concentrado e 1 mL de água oxigenada 30%. Os tubos foram colocados em blocos digestores à temperatura inicial de 160ºC por aproximadamente uma hora, posteriormente aumentou-se a temperatura até atingir 360ºC, por tempo suficiente até tornar a amostra com coloração transparente. Posteriormente, retirou-se os tubos do bloco para esfriar e completou-se com água destilada para um volume final de 50 mL (TEDESCO et al., 1985). Para quantificação da proteína total utilizou-se o método proposto por Kjehdahl (AOAC, 1995), o qual se baseia no teor de nitrogênio total contido na amostra. A partir de uma alíquota de 10 mL da amostra diluída obtida da digestão sulfúrica, procedeu-se a destilação em micro-destilador de nitrogênio (MA 036). O sal formado após processo de destilação, foi titulado com solução padrão de H2SO4
0,2677M, até ponto de viragem, que é a passagem da coloração azulada da amostra para coloração rosa claro. A determinação do teor de
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proteína total foi realizada seguindo a fórmula: % Proteína = conteúdo de N × 6,25 (AOAC, 1995). As análises foram realizadas a partir de três repetições biológicas.
Composição química: para determinação de fósforo (P), zinco (Zn) e ferro (Fe), procedeu-se a digestão sulfúrica (TEDESCO et al., 1985). Para a determinação do fósforo total, tomou-se 1 mL da alíquota digerida, adicionou-se 2mL de água destilada, 3 mL de solução P-B (molibdato de amônia) e 3 gotas de solução P-C (acido1-amino-2-naftol- 4-sulfônico, sulfito de sódio e metabissulfito de sódio), agitou-se e após 15 minutos efetuou-se a leitura da absorbância das amostras em espectrofotômetro na faixa de 660 nm. A partir da alíquota diluída foi determinada a concentração de ferro e zinco através de espectrofotometria de absorção atômica (TEDESCO et al., 1985). A curva padrão para o fósforo foi obtida através de uma solução estoque de 1000 mg.kg-1 de fósforo preparada com um padrão (KH2PO4 -
Tritisol - Merck) diluído para obter as concentrações de: 0; 4; 8; 12; 16 e 20 mg.kg-1de fósforo. Para a preparação da curva padrão de Fe e Zn foi utilizado um padrão (Fe e Zn – Titrisol - Merck), nas seguintes concentrações: 0, 5, 10 e 15 mg/L de ferro e 0, 1, 2 e 5 mg/L de zinco. As análises foram realizadas a partir de três repetições biológicas.
Para avaliação dos genitores e as combinações foi realizado o cálculo da estimativa da heterose (%), comparando-se cada cruzamento com a média de seus pais, por meio da expressão:
Heterose (%) = Média do híbrido – Média dos Pais x100 Média dos Pais
Os dados obtidos foram submetidos a análise de variância e teste de Skott Knott para separação de médias. A análise de multivariada foi administrada usando técnica da variável canônica. A contribuição das características para variação total foi com base na distância generalizada de Mahalanobis (D2) como medida de dissimilaridade, seguindo a metodologia de Singh (1981). A análise estatística foi realizada utilizando o programa Genes (CRUZ, 2006).
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O percentual médio de proteína total nas sementes foi superior a 10%, com variação de 10,93 a 15,03% entre os genótipos parentais e de 11,13 a 15,62% entre os cruzamentos e seus recíprocos (Tabela 2.3).
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Tabela 8.3. Percentual de proteína total e fósforo total em sementes de milho de 8 genitores, 10 cruzamentos intervarietais e seus recíprocos e a estimativa da heterose (H) em relação à média dos pais para os híbridos intervarietais.
Tratamentos Proteína Total Fósforo Total
% H (%) % H (%) 1 12,88b - 1,90g - 2 12,10c - 2,73e - 3 11,32c - 2,83d - 4 10,93c - 2,73e - 5 14,05a - 3,94a - 6 15,03a - 4,02a - 7 14,25a - 3,01c - 8 14,64a - 2,25f - 9 15,23a 21,88 2,60e 12,40 10 15,03a 20,31 2,66e 14,98 11 14,64a 7,91 2,66e -21,21 12 13,47b -0,72 2,87d -15,11 13 13,08b -0,74 2,95c 2,78 14 11,52c -12,59 1,07k -62,58 15 12,69b 4,84 1,50i -36,59 16 12,10c 0,00 1,81h -23,31 17 12,88b -7,69 2,33f -21,36 18 12,69b -9,09 1,30j -56,21 19 15,62a 15,11 3,36b 36,91 20 12,49b -7,91 2,26f -7,89 21 12,30b -10,64 1,56i -24,90 22 13,47b -2,13 1,37j -33,91 23 11,13c -10,94 1,80h -46,01 24 11,91c -4,69 2,00g -40,00 25 12,49b -14,09 1,96g -50,69 26 12,69b -12,75 1,94g -51,17 27 12,10c -6,77 2,56e -24,33 28 12,49b -3,76 2,65e -21,45
Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott & Knott, a 5%.
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Entre os genitores destacou-se o genótipo AS1565 com percentual de proteína de 15,03%, dentre os cruzamentos destacou-se o cruzamento 19 (Pixurum 05 x SJC 5886) com teor de proteína de 15,62%, dentre os recíprocos, o genótipo 10 (Pixurum 05 x MPA 01) apresentou percentual de proteína de 15,03%.
Os resultados indicam a existência de altos teores de proteínas nas sementes avaliadas, os cruzamentos que tiveram os maiores teores apresentam em sua composição exclusivamente genótipos crioulos, além de sementes de melhor qualidade, sugerem a sua utilização como fonte alimentar de elevada qualidade.
O percentual de proteína em sementes de milho estimado em outros trabalhos demonstra valores inferiores ao obtido neste estudo. Castro et al. (2009), ao avaliar sementes de três genótipos de milho normal com um genótipo de milho de alta qualidade proteica (QPM) observaram um percentual proteico de 8,05% para o genótipo normal e 9,21% para o genótipo QPM. Kokuska et al. (2007), comparando o teor de proteína em grãos de milho em dois sistemas de produção agroecológico e convencional em três locais, obtiveram percentual de proteína de 9,24% no sistema agroecológico e 8,07% no sistemas convencional. Bueno et al. (2009), estudoaram o controle genético do teor proteico em grãos de milho submetidos a diferentes níveis de adubação nitrogenada e obtiveram percentual médio de 9,88%. Tais variações podem ser explicadas, pelo fato de que os teores de proteína são caracteres quantitativos e acredita-se que exista um grande número de genes envolvidos no seu controle, podendo haver tanto efeitos aditivos, como não aditivos, importantes no controle do caráter (JESUS et al.,2008).
O elevado teor de proteínas observado nas sementes de milho pode ser um indicativo de alto vigor, visto que o vigor de sementes de gramíneas tem relação com o conteúdo de proteínas no embrião. O teor de proteína apresentou correlação positiva (0,90) com o teste de germinação, e correlação negativa com os testes de frio (-0,79) e envelhecimento acelerado (-0,79). A determinação do teor de proteína não é um teste de vigor, porém, os resultados mostram a possibilidade de associa-la a avaliação do potencial fisiológico das sementes, uma vez que as proteínas catalisam reações químicas ou servem para formar novos tecidos nos pontos de crescimento do embrião (MARCOS FILHO, 2005), verificado no presente através da correlação positiva com o teste de germinação. Este fato pode estar relacionado a eficiência
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do metabolismo, à velocidade de formação e ao vigor das plântulas. O teor de proteínas foi capaz de identificar diferenças entre lotes de arroz com diferentes níveis de potencial fisiológico, podendo ser uma determinação promissora para associação aos testes convencionas para avaliação do potencial fisiológico em sementes de arroz (BORTOLOTTO et al., 2008).
A heterose em relação à média dos pais, para o teor de proteína total (Tabela 2.3), variou de -14,09% (cruzamento 25 Fundacep 35 x AS1565) a 21,88% (9 MPA 01 x Pixurum 05). A heterose média dos cruzamentos foi de -1,72%. Apesar dos genótipos Pixurum 05 e MPA 01 não destacaram-se entre os genitores com elevado teor de proteína, em combinações ambos apresentaram elevada heterose e elevado percentual de proteína (acima de 15%). Apesar do genitor SJC 5886 configurar entre os genótipos com maior percentual de proteína em combinação com outros genótipos, e, sendo ele o genitor feminino, observou-se estimativas de heterose negativa (14 SJC 5886 x MPA 01: heterose – 12,59%; 20 SJC 5886 x Pixurum 05: heterose -7,91%). Por outro lado, este genótipo utilizado como genitor masculino em combinação com Pixurum 05 apresentou estimativa de heterose de 15,11% com elevado percentual de proteína (15,62%), indicando atenção na escolha dos genitores utilizados como parentais femininos e masculinos com vista a obtenção de sementes com maior percentual de proteína. Além da obtenção de sementes de melhor qualidade, os resultados obtidos sugerem que estes híbridos intervarietais apresentam potencial para serem utilizados como fonte proteica diferencial para a alimentação. No entanto estudos em diferentes ambientes precisam ser realizados para confirmação dos elevados teores de proteína. Apesar disso, estes resultados são indicativos de que as variedades crioulas apresentam elevados teores de proteína podendo também ser utilizados pelos pequenos agricultores em estratégias de diversificação produtiva, como a produção de farinha com características diferenciais, agregando valor aos sistemas produtivos e promovendo a conservação dos recursos genéticos.
Dos cruzamentos realizados apenas cinco (9 MPA 01 x Pixurum 05; 10 Pixurum 05 x MPA 01; 11 MPA 01 x AS 1565; 15 Pixurum 05 x SCS 155 Catarina; 19 Pixurum 05 x SJC 5886) apresentaram heterose positiva para o teor de proteína. Para os demais cruzamentos as estimativas foram negativas. Resultados semelhantes foram observados por outros autores. Bueno et al. (2009), trabalhando com híbridos comerciais intercruzados em um esquema dialélico completo,
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observaram que o efeito da heterose para proteína em grãos não foi significativa, e a estimativa da heterose foi muito pequena (-036 g 100g-
1
), indicando que efeitos de dominância tem pouca importância na manifestação deste caráter e que deve-se buscar o aproveitamento de genes de efeito aditivo, de maior importância para a expressão desse caráter, por meio de seleção recorrente para obtenção de parentais com maiores teores de proteína. Medici et al. (2004) também indicaram a existência de heterose negativa no teor de N nos grãos, ao trabalhar com linhagens de milho contrastantes no uso de N, em cruzamentos dialélicos.
Os genótipos AS1565 e Fundacep 35 apresentaram teores de fósforo superiores em relação aos demais genitores, 4,02 e 3,94% respectivamente (Tabela 2.3). Dentre os cruzamentos, o híbrido 19 (Pixurum 05 x SJC 5886) apresentou teores de fósforo superiores aos demais 3,36%. Com relação à heterose os cruzamentos 9 (MPA 01 x Pixurum 05), 10 (Pixurum 05 x MPA 01) e 19 (Pixurum 05 x SJC 5886) apresentaram estimativas positivas, 12,40, 14,98 e 36,91%, respectivamente; os demais tiveram estimativas negativas para o teor de fósforo. Não houve efeito recíproco entre os cruzamentos avaliados. Verificou-se que os cruzamentos compostos por variedades crioulas apresentaram os maiores valores para teor de fósforo e consequentemente heterose positiva. Essa superioridade pode estar relacionada a diversidade genética contida nestes genótipos, que não sofreram nenhum processo de melhoramento convencional.
Os genótipos que apresentaram elevado teor de proteína apresentaram maiores teores de fósforo, o que foi comprovado pela alta correlação entre ambos, de -0,9619 (P<0,05), o que reforça a atenção de que o aumento de um componente na semente muitas vezes pode estar relacionado com um aumento no outro, neste caso esta relação é muito importante em função do fósforo ser um elemento essencial no metabolismo das plantas, desempenhando um papel importante na transferência de energia da célula, na respiração e na fotossíntese; é também componente estrutural de muitas coenzimas, fosfoproteínas e fosfolipídeos (ZUCARELLI et al., 2006), o que enfatiza a necessidade de análises desta natureza nas sementes.
Ao se correlacionar o teste de germinação com as avaliações do