Introdução

Os marcadores moleculares referem-se a diferenças entre indivíduos nas suas sequências de nucleotídeos ao longo da fita de DNA e podem ser classificados em função de sua herança, como dominantes e codominantes. Em indivíduos diploides, marcadores codominantes permitem a distinção de ambos os alelos homólogos de um loco. Já os marcadores dominantes são menos informativos, pois não permitem distinguir o fenótipo heterozigoto do homozigoto (Ferreira e Grattapaglia, 1995).

Diversas técnicas têm sido utilizadas para verificar a variabilidade genética diretamente no DNA, destacando-se: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) e STS (Sequence- Tagged Site), em que se destacam os SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions), os ISSRs (Inter- simple Sequence Repeats) e os microssatélites. Estes marcadores podem diferir com respeito a características importantes como abundância genômica, nível de polimorfismo detectado e informação genética, especificidade dos locos, reprodutibilidade, requerimentos técnicos e investimento financeiro (Buso et al., 2003).

Entre os marcadores moleculares mais adequados para o estudo da estrutura genética, reprodução e fluxo gênico de populações arbóreas, encontram- se os marcadores microssatélites (ou Sequências Simples Repetidas – SSR), os quais se tornaram uma ferramenta útil na construção de mapas genéticos, análise de paternidade e fluxo gênico (Chase et al., 1996). As frequências dos microssatélites variam significativamente entre os diferentes organismos, sendo que o genoma de plantas contém, em média, dez vezes menos microssatélites do que o genoma humano (Gupta et al., 1996).

Os microssatélites formam uma classe de DNA caracterizada por sequências de 1 a 6 nucleotídeos, repetidas em tandem, que apresentam uma alta taxa de mutação, variando de 10-6 _{a 10}-2 _{por geração (Eisen, 1999). As mutações}

são causadas por alterações no número das unidades de repetição, sendo que a maioria dessas alterações resulta de mudanças no número integral de cópias das unidades de repetição (Eisen, 1999). Dois modelos podem explicar estas alterações: o crossing-over desigual entre as moléculas de DNA, resultado da recombinação entre cromossomos homólogos que não foram alinhados corretamente; e o mecanismo do slippage da DNA polimerase. Este último modelo

é o mais aceito e ocorre durante a replicação do DNA e conduz ao aumento ou à diminuição do número de repetições (Tautz e Schlotterer, 1994).

As unidades de repetição dos microssatélites são, geralmente, mono-, di-, tri- ou tetranucleotídeos. Segundo Oliveira et al. (2006), microssatélites são classificados de acordo com o tipo de sequência repetida, podendo ser perfeitos (a sequência repetida não é interrompida por nenhuma base), imperfeitos (há um par de bases dentro do motif de repetição), interrompidos (há uma pequena sequência de bases dentro da sequência repetida do microssatélite) e compostos (em que há duas sequências repetidas distintas adjacentes).

Devido à distribuição preferencial nas regiões não codificadoras, os microssatélites podem não sofrer ação da seleção natural, o que os torna seletivamente neutros e muito úteis para estudos da genética das populações naturais (Eisen, 1999). O potencial dos SSRs como marcadores úteis foi reconhecido por possuírem uma série de características desejáveis como distribuição ao acaso e ocorrência em grande quantidade em genomas de eucariotos e procariotos, codominância dos alelos, facilidade de detecção via PCR, e alta diversidade alélica (Chase et al., 1996; Borém, 2007). Alem disso, são suficientemente estáveis para serem utilizados em análises genéticas e de evolução de populações naturais, especialmente em espécies arbóreas altamente diversas, como já vem sendo demonstrado para espécies tropicais (ver Tabela 2 com exemplos de espécies florestais brasileiras).

Outra característica muito interessante dos SSRs é sua fácil repetitibilidade, dado que é possível obter os mesmos resultados em qualquer laboratório do mundo (Cenis, 2000). Assim, os marcadores microssatélites são ideais para gerar informações para análises de diversidade genética, sistemas de reprodução e fluxo gênico em populações de plantas, pois essas ferramentas permitem estimar frequências alélicas, possuem alto poder de exclusão de paternidade, com segregação mendeliana e alto polimorfismo (Lian et al., 2001).

O desenvolvimento de marcadores microssatélites tem se tornado mais acessível nos últimos anos, devido às novas estratégias de enriquecimento de bibliotecas genômicas e à rapidez no sequenciamento automático baseado na fluorescência (Zane et al., 2002) . Ainda que o desenvolvimento de marcadores SSR demande tecnologias moleculares refinadas, esse se torna compensador pela quantidade de informações genéticas que podem ser geradas.

microssatélites de cada espécie, já que os SSR são usualmente encontrados em regiões não codificadoras, onde a taxa de substituição dos nucleotídeos é maior do que em regiões codificadoras. Esse fato inviabiliza o uso de primers universais correspondentes a sequências conservadas, estratégia muito efetiva para DNA mitocondrial (Zane et al., 2002). Uma alternativa para eliminar tempo e despesas envolvidas no isolamento de marcadores microssatélites para a espécie de interesse é a utilização de primers heterólogos. Esse potencial tem sido observado em diferentes estudos (Cipriani et al., 1999; Collevatti et al., 1999; Roa et al., 2000; Yamamoto et al., 2001; Alves et al., 2003; Zucchi et al., 2003; Decroocq et al., 2003; Braga et al., 2007; Santos et al. 2007; Ciampi et al., 2008; Nazareno et al., 2009; Feres et al., 2009; Guidugli et al., 2010) e é possível graças à conservação de regiões flanqueadoras para alguns locos microssatélites entre espécies relacionadas. Tal constatação permite o aproveitamento de primers espécie- específicos em outras espécies proximamente aparentadas.

Até o momento, não havia disponibilidade de marcadores microssatélites específicos para o gênero Anadenanthera. Sendo assim, o objetivo principal desta etapa da pesquisa foi obter um conjunto de primers que amplificassem locos independentes de microssatélites polimórficos do genoma de Anadenanthera

colubrina. Em seguida, foi investigada a transferência e caracterização destes locos

em A. peregrina com o intuito de completar os estudos genéticos deste importante gênero.