O gênero Burkholderia pertence ao sub filo β-proteobactéria (YABUUCHI et al., 1991) e compreende 96 espécies originadas de diferentes ambientes, incluindo: rios, sedimentos, solo associadas a plantas, humanos e animais (LPNS, 2016). Dentre as duas principais ramificações existentes, uma delas é composta por espécies ambientais que não causam doenças. Dentre as 96 espécies, 20 têm a capacidade de fixar nitrogênio atmosférico (GILLIS et al., 1995; ACHOUAK et al., 1999; COENYE et al., 1999; ZHANG et al., 2000; COENYE et al., 2001; VANDAMME et al., 2002; CABALLERO-MELLADO et al., 2004; GORIS et al., 2004; REIS et al., 2004; CHEN et al., 2006; PERIN et al., 2006; CHEN et al., 2007; ELLIOTT et al., 2007; CHEN et al., 2008; AIZAWA et al., 2010; AIZAWA et al., 2011; DE OLIVEIRA CUNHA et al., 2012; SHEU et al., 2012; MARTÍNEZ-AGUILAR et
al., 2013; SHEU et al., 2013). E dentre as fixadoras, várias espécies são capazes de fixar
nitrogênio atmosférico por meio da formação de nódulos em associação com plantas leguminosas (TALBI et al., 2010; LIU et al., 2011; ORMEÑO-ORRILLO et al., 2012; BEUKES et al., 2013; BOURNAUD et al., 2013; ANGUS et al., 2014; DE OLIVEIRA- LONGATTI et al., 2015). Além disso, existem várias espécies, diazotróficas ou não, que podem colonizar a rizosfera e/ou endofiticamente uma ampla gama de espécies de plantas como, milho, sorgo, cana-de-açúcar, arroz, abacaxi e café (GILLIS et al., 1995; ACHOUAK
et al., 1999; COENYE et al., 1999; COENYE et al., 2001; CABALLERO-MELLADO et al.,
2004; GORIS et al., 2004; REIS et al., 2004; PERIN et al., 2006; AIZAWA et al., 2011; DE OLIVEIRA CUNHA et al., 2012; MARTÍNEZ-AGUILAR et al., 2013).
Entre essas espécies que se associam com plantas não leguminosas, está a
Burkholderia tropica (REIS et al., 2004), que é uma bactéria Gram negativa, que fixa
nitrogênio sob condições microaeróbicas nos meios JMV semi-sólido livre de nitrogênio, LGI-P e BAz (BALDANI et al., 2014). Bactérias do gênero Burkholderia colonizam a rizosfera e tecidos internos de uma ampla gama de plantas hospedeiras incluindo a cana-de- açúcar (CABALLERO-MELLADO et al., 2004; REIS et al., 2004; PERIN et al., 2006; COMPANT et al., 2008; MATTOS et al, 2008). O apoplasto, potencial nicho bacteriano, constitui os espaços intercelulares (o meio extracelular), espaços aquosos externos à membrana plasmática incluindo a parede celular e o xilema (HASLAM et al., 2003). Portanto, o apoplasto representa um compartimento altamente dinâmico que serve como um contínuo que vai da raiz, passando pelo caule e chegando até as folhas, sendo bastante importante no que tange a percepção e transdução de sinais do ambiente para o simplasto (meio intracelular) (PECHANOVA et al., 2010).
De acordo com SATTELMACHER (2001), endófitos bacterianos presentes no apoplasto promovem o crescimento da planta, especialmente por aumentar a resistência a fatores bióticos e abióticos e por ter ação direta na nutrição mineral das plantas. DOBEREINER, em 1992, já havia sugerido que bactérias diazotróficas endofíticas seriam beneficiadas por esse nicho por não existir competição por fontes de carbono e redução de oxigênio disponível o que importante para o funcionamento da nitrogenase. O fluido do apoplasto de cana-de-açúcar é constituído, principalmente, por sacarose, glicose, frutose e ácido aconítico, que podem ser utilizados pelos endófitos como fontes de carbono (DONG et
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orgânicos dissolvidos, bem como enzimas conhecidas como invertases ácida e neutra nos vasos do xilema para acúmulo de sacarose (HATCH & GLASZIOU, 1963). Além disso, contém ácidos orgânicos como aconitato, citrato, malato, fumarato, oxalato e glicolato e açúcares como xilose, arabinose, galactose, frutose, glicose e sacarose (VICENTE et al., 1991; BELLONE & BELLONE, 2006). Estes nutrientes estão presentes em todos os órgãos da parte aérea, contudo, sua concentração varia dentro da planta de acordo com o crescimento e desenvolvimento de regiões particulares (BELLONE & BELLONE, 2006). É sabido que a
B. tropica estirpe Ppe8 utiliza várias fontes de carbono que podem estar presentes tanto no
fluido do apoplasto quanto no caldo de cana-de-açúcar, tais como N-acetilglicosamina, DL- arabinose, D-arabitol, D-frutose, galactose, gluconato, D-glicose, glicerol, inositol, 2- cetogluconato, malato, manitol, D-manose, fenilacetato, sorbitol e D-xilose (REIS et al., 2004). Porém ainda não se tem informações sobre a expressão gênica da bactéria na presença do fluido do apoplasto de cana-de-açúcar nem como a bactéria se comportaria na presença do caldo de cana ou das fontes de carbono que o compõem.
O método de transcrição reversa, seguida pela reação em cadeia da polimerase (RT- qPCR) é considerado o método preferencial para estudos em expressão gênica diferencial de mRNA em diferentes condições (BUSTIN et al., 2009) uma vez que é altamente sensível e específico (BUSTIN et al., 2009). A RT-qPCR pode ser usada tanto para métodos independentes para análise de expressão quanto para validar dados em comparação a genes de referência, por exemplo, genes que possuem estabilidade de expressão sob várias condições experimentais (DALLAS et al., 2005). Em um trabalho recente, foi mostrada uma lista de genes comumente empregados como referência: 16S rRNA, gyrA, recA, rpoB, rpoA, gyrB,
gap, rho, ftsZ, secA, rpoC, gmk, adk, rpoD, dnaG, glnA, ldhD e recF em estudos com
bactérias cultivadas em diferentes condições (ROCHA et al., 2015). A escolha correta do gene referência é muito importante em função das variações ambientais que podem levar a interpretações incorretas dos resultados (VANDESOMPELE et al., 2002). Um estudo com o endófito diazotrófico G. diazotrophicus estirpe PAL5, indicou os genes 23S rRNA, rho e recA como genes de referências apropriados para avaliar a expressão gênica durante o crescimento da bactéria em diferentes fontes de carbono (GALISA et al., 2012). Similarmente, os genes
gyrA, glyA e recA foram escolhidos para três estirpes de A. brasilense crescidas em diferentes
tipos de meio de cultivo (MCMILLAN & PEREG, 2014). A seleção de genes de referência também tem sido realizada para várias bactérias não diazotróficas, incluindo Bacillus cereus (REITER et al., 2011), Escherichia coli (ZHOU et al., 2011), Clostridium difficile (METCALF et al., 2010), dentre outras. Contudo, não existem dados publicados usando genes de referência para B. tropica estirpe Ppe8. Para tanto, apesar de diversos trabalhos terem sido publicados com bactérias, não existem genes de referência comuns a todas e, portanto, o uso inapropriado desses genes pode levar a resultados incorretos (DHEDA et al., 2005). Além disso, o conjunto de genes de referência devem ser validados dentro de uma condição experimental específica para posteriormente usá-los como normalizadores (DHEDA
et al., 2005).
Diante do exposto, o objetivo do trabalho deste capítulo foi a seleção e validação de genes de referência para a bactéria diazotrófica B. tropica estirpe Ppe8 cultivada em diferentes fontes de carbono visando o seu emprego nos estudos de validação do transcriptoma da Ppe8 cultivada no líquido do apoplasto de cana-de-açúcar.
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