Investigação das vias metabólicas dos corantes

Esta etapa do trabalho foi realizada no Instituto de Química da UNESP de Araraquara, com a colaboração da Profa. Dra. Maria Valnice Boldrin Zanoni.

As vias metabólicas dos corantes estudados neste trabalho foram investigadas utilizando reações de oxidação e redução. As reações de oxidação foram avaliadas por meio de três técnicas diferentes: uma técnica enzimática (reação com a mistura S9) e duas técnicas químicas (espectroeletroquímica e eletrólise a potencial controlado). Já as reações de redução foram realizadas apenas pelas duas técnicas químicas utilizadas na oxidação.

Para este conjunto de análises, inicialmente foi realizado um experimento piloto, a fim de determinar as melhores condições de trabalho. Para tanto, foi feito um perfil espectrofotométrico dos três corantes em diferentes concentrações (2,5 x 10-5 mol/L; 5,0 x 10-5 mol/L; 7,5 x 10-5 mol/L e 1,0 x 10-4 mol/L) dissolvidos em DMSO, com o objetivo de escolher a melhor concentração para as investigações metabólicas.

3.2.2.1 Oxidação pelo sistema de metabolização microssomal de fígado de rato (mistura S9)

O sistema de metabolização S9 é largamente utilizado em ensaios de mutagenicidade (principalmente o ensaio de mutagenicidade com

Salmonella/microssoma) com o objetivo de mimetizar as reações de oxidação via

citocromo P450. Estas reações são de extrema importância em Toxicologia, pois podem gerar produtos mais ou menos tóxicos, ou seja, bioativação e destoxificação, respectivamente.

Como já citado no item Introdução, em trabalhos anteriores realizados por Ferraz (2008, 2010), foi verificado que os corantes Disperse Red 1, Disperse Red 13 e Disperse Orange 1 são mutagênicos no ensaio de mutagenicidade com

Salmonella. Porém, quando o ensaio foi realizado na presença de S9, este efeito foi

reduzido. Por este motivo, neste trabalho foi realizada a reação dos três corantes com a mistura S9, acompanhados espectrofotometricamente, visando monitorar o efeito da reação via citocromo P450 no grupamento cromóforo dos corantes.

Preparo da mistura S9 – 4%v/v:

O preparo da mistura S9 foi realizado seguindo o protocolo estabelecido para o ensaio de mutagenicidade de Salmonella (MARON; AMES, 1983). Cada 100 mL de mistura S9 é composto por 39,5 mL de água destilada estéril, 50 mL de tampão fosfato 0,2 M, 4 mL de NADP, 0,5 mL de glicose-6-fosfato 1,0 M, 2 mL da solução de sais (KCl 1,65 M e MgCl2 0,4 M) e 4 mL de fração S9, preparadas conforme descrito no item 3.2.1.3. Essa solução sempre foi preparada assepticamente, em banho de gelo, seguindo a ordem dada na adição dos reagentes. Essa solução é válida por 3 horas, sendo então descartadaapós esse tempo.

Como será demonstrado no item Resultados, a melhor concentração de trabalho dos corantes foi de 1,0 x 10-4 mol/L. Uma vez fixada esta concentração, as proporções de S9 foram variadas (50 a 500 µL), a fim de escolher a quantidade ideal de S9 para metabolizar in vitro os corantes em análise. As soluções de cada corante (1,0 x 10-4 _{mol/L) foram incubadas com os volumes variados de S9 por 90 minutos a} 37ºC. Devido à precipitação das proteínas da fração S9, ocorreu interferência na leitura espectrofotométrica. Sendo assim, decidiu-se extrair o produto da reação entre os corantes e o S9, utilizando diclorometano. Para isso foram colocadas 3

alíquotas de 3 mL de diclorometano, agitando logo em seguida. Após a total secagem de cada extrato à temperatura ambiente, foi colocado metanol para ressuspendê-lo e, então, foram feitas as análises.

As análises dos produtos formados a partir das reações com o S9 foram acompanhadas por sistema de cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE/DAD) (Shimadzu SCL-10AVR e HP 8453, respectivamente) e as medidas espectrofotométricas foram realizadas em espectrofotômetro Hewlet Packard modelo 8453.

As condições do CLAE/DAD foram: fase móvel acetonitrila: água (80:20 v/v), fluxo de 1 mL/min., volume de injeção de 20 µL, temperatura ambiente para a coluna de separação G-ODS (C18) Varian (4 mm x 250 mm, 5 µm).

3.2.2.2 Oxidação e redução espectroeletroquímica dos corantes

A técnica de espectrofotometria Ultravioleta-Visível tanto para oxidação (potencial +1,5 V) como para redução (-1,5 V) tem sido utilizada com sucesso pelo grupo da Profa. Dra. Maria Valnice Boldrin Zanoni com o intuito de mimetizar as reações endógenas no grupamento azo dos corantes.

As soluções dos corantes Disperse Red 1, Disperse Red 13 e Disperse Orange 1 foram preparadas em dimetilsulfóxido (DMSO) contendo tetrafluorborato de tetrabutilamônio (TBABF4) a 0,1 mol/L como eletrólito suporte. Após uma etapa de remoção de oxigênio, borbulhando nitrogênio (99,7% de pureza) durante 10 minutos, foram feitas as análises do processo de redução dos corantes.

A célula espectrofotoeletroquímica foi montada em uma cubeta de quartzo, onde foi introduzido um fio de ouro como eletrodo de trabalho, um fio de platina como eletrodo auxiliar e um eletrodo de Ag/AgCl como eletrodo de referência conectado ao sistema através de um capilar de Luigin, onde todo o sistema foi conectado a um potenciostato e a um espectrofotômetro de arranjo de diodos HP 8453 interligado a um microcomputador HP Kayak. Os espectros foram monitorados em função da oxidação ou redução dos corantes sob potenciais fixos e as mudanças dos espectros monitoradas simultaneamente no intervalo de 200 a 1200 nm no espectrofotômetro. As reações foram monitoradas por meio de leituras a cada 10 minutos até o tempo máximo estipulado para cada corante, como será mostrado no item Resultados.

3.2.2.3 Eletrólise a Potencial Controlado

Para investigar as vias metabólicas dos corantes foi utilizada também outra técnica, a Eletrólise a Potencial Controlado. Nesta técnica é possível utilizar concentrações mais altas dos corantes e em maiores volumes (25 mL). Esse fato é interessante, pois além de avaliar o potencial eletroquímico dos corantes, os produtos de reação ainda puderam ser utilizados na análise por CLAE/DAD e por CG/EM, visando identificar possíveis aminas aromáticas e outros compostos formados. Ademais, estes produtos foram utilizados no ensaio de mutação gênica em células de linfoma de camundongo e no teste de mutagenicidade com

Salmonella, descritos nos itens 3.2.1.2 e 3.2.1.3, respectivamente. Para tanto, foi

realizada a monitorização das mudanças espectrais durante a redução e a oxidação desses corantes em meio não aquoso, visando obter informações sobre a formação de espécies radicalares. Assim, soluções estoque dos corantes Disperse Red 1, Disperse Red 13, e Disperse Orange 1, em concentração de 3,18 x 10-4 mol/L e 6 x 10-3 mol/L, foram preparadas pela dissolução direta dos corantes em DMSO/TBABF4 a 0,01 mol/L (eletrólito de suporte). As medidas foram realizadas em um Potenciostato/Galvanostato AUTOLAB 71355 - ECO CHEMIE e um microcomputador IBM-286. Além disso, as reações por eletrólise foram monitoradas por CLAE/DAD, utilizando o método padronizado por Osugi et al. (2009). O equipamento utilizado foi um Shimadzu modelo SCL-10AVP com injeção automática. A coluna de separação utilizada foi G-ODS (C18) Varian (4 mm x 250 mm, 5 µm) e a fase móvel foi acetonitrila: água (80:20 v/v) com vazão de 1 mL/min, em temperatura ambiente. Em todas as análises cromatográficas, as amostras foram previamente filtradas em filtros de PTFE (Politetrafluoretileno)de 0,45 µm.

No ensaio de redução eletroquímica, as soluções foram previamente submetidas à desaeração por 10 minutos através do borbulhamento de N2 (99,7% de pureza).