Isolamento e Clonagem do cDNA da Toxina da Soja (SBTX)

Conforme descrito anteriomente, a SBTX é uma proteína de massa molecular aparente 44 kDa, composta por duas cadeias polipetídicas unidas por pontes dissulfeto. Embora seja uma proteína que, através de técnicas imunológicas, tenha sido detectada em outras partes do vegetal (SIEBRA, 2004), sua fonte principal é, na verdade, o cotilédone de soja. Dessa forma, com o objetivo de isolar e clonar o cDNA codificante de SBTX, as sementes dessa espécie foram utilizadas como fonte de RNA para a síntese de cDNA.

Sementes da cultivar BRS-Pala foram plantadas em casa de vegetação sob condições ótimas de plantio no que diz respeito à temperatura (25 °C), umidade atmosférica (mantida sempre em torno de 70%), pH do solo (5,5) e irrigação periódica de forma manual, objetivando atender as necessidades fisiológicas dessa espécie (que variam de 400 a 800 mm de água/ciclo) e evitar a ocorrência de estresses que pudessem prejudicar seu desenvolvimento normal. Assim, características do ciclo biológico da cultivar BRS - PALA, como tempo para abertura das flores e altura média das plantas foram usados como parâmetros para a coleta de sementes, tendo sido retiradas apenas aquelas que atingiram os parâmetros esperados para a cultivar, divulgados pela EMBRAPA.

A coleta das sementes utilizadas para extração de RNA foi determinada a partir da abertura das flores da planta (antese) em intervalos de dias. Experimentalmente, foi determinado que, para a cv. BRS-Pala o tempo médio para abertura das flores foi de 37 ± 1 dias após o plantio, um ciclo de total de 118 a 125 dias e as plantas apresentaram, quando adultas, uma altura de 49 cm. As sementes foram retiradas 15, 25 e 35 dias após a antese, medidas e pesadas para

126 estimativa do peso fresco total. Sementes com 15 dias apresentaram massa total de 30 mg, havendo um incremento do peso fresco em 25 (80 mg) e 35 dias (140 mg) após a antese. Os intervalos de coleta da semente foram assim definidos com o objetivo de extrair RNA de diferentes fases do enchimento do grão, maximizando, portanto, a obtenção de transcritos para a proteína de interesse.

A partir das sementes obtidas foi realizada a extração de RNA total, seguindo a metodologia descrita anteriomente, quantificação e análise de integridade e pureza do material extraído. Cerca de 2.840, 1.670 e 3.730 _g/_L de RNA foram extraídos de sementes com 15, 25 e 35 DAA, respectivamente, os quais apresentaram razão A260/A280 de 1,88, indicando seu elevado grau de pureza. A Figura 04 mostra a eletroforese em gel de agarose 1% dos RNAs extraídos nos intervalos citados, destacando a presença de duas bandas principais correspondentes ao RNA ribossomal 28S e 18S, sendo a primeira banda mais intensa do que a segunda, demonstrando também que o RNA extraído estava livre de degradação.

O RNA extraído foi, então, utilizado para obtenção da primeira fita de cDNA. O cDNA obtido foi submetido à reação em cadeia de polimerase com os primers senso e antisenso para a [-actina, com o objetivo de testar a qualidade do cDNA produzido, antes dos procedimentos de isolamento de cDNA da SBTX. A amplificação da segunda fita de DNA a partir de amostras não diluídas de cDNA, usando os primers específicos para a actina, mostrou a ocorrência de uma banda de 400 pb demonstrando a qualidade do cDNA a ser usado na clonagem.

A clonagem do cDNA de SBTX foi realizada, inicialmente, partindo-se de condições padrão de PCR, descritas na literatura. O cDNA não foi diluído para uso nas reações e a temperatura de anelamento inicial foi de 55 °C. Não foram amplificados fragmentos de DNA nessas condições de reação quando utilizados primers degenerados ou não degenerados para as cadeias polipeptídicas de SBTX em diferentes combinações possíveis ou ainda, juntamente com os primers oligo- dT - AP e AP. Dessa forma, novas condições de PCR foram testadas utilizando temperaturas de anelamento mais baixas e de: 52,8; 51,8; 39,9; 37,3 e 35 °C.

Figura 04. Eletroforese em gel de agarose 1% do RNA extraído de sementes de soja em diferentes estágios de maturação. As bandas foram visualizadas através de brometo de etídeo (0,01 ng/µL) sob luz ultravioleta. Raia M - marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder (Invitrogen®_{). Raias 15, 25 e 35 indicam}

amostras de RNA nos respectivos intervalos de coleta em dias após a antese.

M 15 25 35 12.000 5.000 2.000 1.650 1.000 850 650 500 400 300 200 100 pb

128 Para as novas temperaturas de anelamento testadas foram conduzidas duas reações de PCR. Na primeira, os primers 27F1 e Oligo d(T) – AP, 27F1 e AP, 27F1 e 17R1, 17F1 e Oligo d(T) – AP ou 17F1 juntamente com o primer AP foram utilizados para amplificação, sendo as mesmas combinações testadas para os primers degenerados. A segunda reação de PCR foi conduzida tal como as primeiras, mas utilizando 1 µL do DNA amplificado na primeira PCR como molde.

A análise em gel de agarose dos materiais provenientes de diferentes condições de amplificação mostrou que, apenas para a PCR conduzida com os primers 27F1 e AP houve amplificação de fragmentos de DNA em todas as temperaturas testadas (Figura 05). Nas temperaturas de 35, 37,3 e 39,9 °C foram obtidos fragmentos de DNA com tamanhos de aproximadamente 1400 e 430 pb, ao passo que nas temperaturas mais altas (51,8 e 52,8 °C) foram amplificadas bandas de tamanho superior a 2000 pb. Para a SBTX seriam esperados até três tamanhos de fragmentos possíveis: um fragmento em torno de 1320 pb que codificaria toda a cadeia polipeptídica de 44 kDa e fragmentos de aproximadamente 810 e 510 pb, codificantes das cadeias polipeptídicas de 27 kDa e 17 kDa, que fazem parte da proteína nativa. Dessa forma, considerando os tamanhos esperados, somente os fragmentos de 1400 e 430 pb foram utilizados nos passos seguintes de clonagem, sendo desprezadas as moléculas obtidas nas temperaturas maiores de 50 °C. Com o objetivo de se obter uma maior quantidade de DNA, a temperatura de 37,3 °C (segunda reação de PCR) foi escolhida para dar prosseguimento à clonagem das duas bandas obtidas.

Foram, então, realizadas oito reações de PCR nas condições já estabelecidas e ao final do processo, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose para separação e purificação do DNA do gel. Para as bandas de 1400 e 430 pb foram obtidos, respectivamente, cerca de 98 ng/µL e 94 ng/µL de DNA, usados para inserção no vetor de clonagem pGEM-TEasy, produzindo o DNA recombinante que foi utilizado para transformar células competentes de E. coli (XL1-Blue).

Figura 05. Eletroforese em gel de agarose (1%) dos produtos de PCR obtidos após amplificação com os primers SBTX 27F1 e AP em diferentes temperaturas de anelamento. As reações de PCR foram conduzidas nas temperaturas de anelamento indicadas na imagem. O número “1” indica primeira reação de PCR e 2 representa segunda reação de PCR usando como DNA molde material amplificado na primeira reação. Seta azul – banda ~ 1400 pb; Seta vermelha – banda ~ 430 pb; Raia M - marcador 1 kb DNA Ladder (Invitrogen®_).

12.000 5.000 2.000 1.650 1.000 850 650 500 400 300 200 100 pb 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 52,8 °C 51,8 °C 39,9 °C 37,3 °C 35,0 °C

130 Os clones positivos foram primariamente identificados pela resistência ao antibiótico ampicilina (100 _g/mL) adicionado ao meio de crescimento bacteriano e colônias repicadas em placas com ampicilina contendo IPTG e X-Gal crescidas com a coloração branca foram consideradas potencialmente transformadas com o cDNA de interesse.

Para as células transformadas com o plasmídeo contendo o inserto de aproximadamente 1,4 kb foram obtidas 7 colônias. Para os plasmídeos contendo o framento de 0,4 kb foram obtidas 11 colônias representando clones positivos. Em seguida, as colônias brancas contendo os insertos foram repicadas em meio LB contendo ampicilina e deixadas crescer por 16 h, 37 °C, 200 rpm. As células bacterianas foram submetidas à extração de DNA plasmidial pelo método de lise alcalina e o DNA obtido foi submetido à análise de restrição.

A Figura 06 mostra o resultado do perfil de digestão dos clones selecionados. Para as colônias transformadas com o plasmídeo contendo o inserto de 1,4 kb, das sete colônias selecionadas, apenas duas apresentaram o inserto como mostrado no resultado da digestão. Para as colônias transformadas com o fragmento de 0,4 kb, cinco clones apresentaram o inserto. Todos os clones positivos foram submetidos ao sequenciamento automatizado de DNA usando amostras de DNA de 80 ng/µL e iniciadores T7 (Foward) e SP6 (Reverse).

A partir do seqüenciamento foi obtido um segmento de 1327 pb, correspondente ao material de aproximadamente 1,4 kb clonado em E. coli. Análises em BLASTn (NCBI) mostraram identidade de 100% das sequências obtidas com uma sequência (AK243932.1 e ) depositada no banco de dados para a espécie G. max. A sequência completa de AK243932.1 possui 1492 pb e uma ORF que codifica uma proteína putativa de 378 resíduos de aminoácidos e massa molecular aproximada de 43 kDa, mas não possui em seu NH2-Terminal

nenhum resíduo de aminoácido obtido para as cadeias polipeptídicas de SBTX. Uma busca por similaridade através do algoritmo BLASTp mostrou que essa sequência é putativa para uma enzima de soja chamada de formato desidrogenase, que possui similaridade com várias outras sequências depositadas como aquelas de Quercus robur e Lotus japonicus, não se tratando, portanto do cDNA de SBTX.

Figura 06. Análise de restrição dos plasmídeos provenientes de colônias brancas transformadas com os insertos de ~ 1400 pb e 430 pb. Trinta microgramas de DNA plasmidial foram digeridos com a enzima de restrição EcoRI 2,5 U por 3 horas. As setas indicam os insertos de interesse.

132 Por outro lado, o seqüenciamento também forneceu um fragmento de 463 pb, contendo na extremidade 5’ a sequência completa do primer 27F1 (não degenerado). A Figura 07 mostra a sequência completa do fragmento de 0,4 kb juntamente com a sequência de aminoácidos deduzida com o uso da ferramenta Translate (disponível em www.expasy.ch). Como pode ser observado, todos os resíduos de aminoácidos usados para o desenho do primer 27 F1 estão presentes na sequência deduzida, juntamente com outros resíduos presentes na cadeia polipeptídica. Em função de esses aminoácidos estarem presentes na subunidade de 27 kDa de SBTX, os dados sugerem fortemente que esse sequência é parte do cDNA da subunidade de 27 kDa da toxina da soja.

Para a soja estão depositadas atualmente mais de 1,7 milhões de sequências nucleotídicas nos bancos de dados do NCBI, além de informações referentes às EST’s dessa espécie, como parte do estudo de seu genoma e transcriptoma. Considerando a riqueza de informações a respeito de sequências de nucleotídeos disponíveis para essa espécie, a sequência parcial de nucleotídeos encontrada experimentalmente (463 pb) foi utilizada para buscar a sequência completa da subunidade de 27 kDa através do alinhamento usando a ferramenta BLASTn.

A Tabela 02 mostra três dos alinhamentos encontrados para a sequência parcial obtida para SBTX na base de dados do SoyBase (Integrating Genetics and Molecular Biology for Soybean Researchers). A busca foi realizada contra as sequências de EST’s disponíveis para soja. Foram encontradas 29 sequências com escore máximo de alinhamento (e-value 0.0), dentre as quais podem ser citadas sequências provenientes de plantas infectadas com Phytophthora sojae, de tecidos do endosperma em desenvolvimento e de uma proteína ligante de grupamentos citrato, as quais, se alinhadas, mostram ser o mesmo material.

CTTTTGGATTTACTCCTTTGGGTTTATCTAGTAGCTCAAACTTGCAAATCCAAAAGCCTTAC F G F T P L G L S S S S N L Q I Q K P Y GACGTTGCAGTCAACGAGCGCTACAGCTTTTCAAATGGAGTGCACAGATTTTGGGTATAC D V A V N E R Y S F S N G V H R F W V Y TCCACGGACAAGCCTCATATGCAAGGCAGCAATACGAAGCCACGAACTGAGATTCGTATC S T D K P H M Q G S N T K P R T E I R I GCTGGATACGATTATACATCCGGTGTGTGGCAATTTCAAGGGTTTTTTTACGTGCCTAGT A G Y D Y T S G V W Q F Q G F F Y V P S GGCACAAGCGGGGTGTGCATCCAGCAAGTGTTTGGTGGAGTAACTTCTGCCACAACCTCG G T S G V C I Q Q V F G G V T S A T T S CAGACTAGGGTCTATGGTGGTTCTCTCACTCATTACCAATCACCTACTCTGGAACCAAAC Q T R V Y G G S L T H Y Q S P T L E P N ATCTATAATAGGTGGATCCGGTTTAACGTGATCCATGATGTGGGTGCCAACAATGTGAAG I Y N R W I R F N V I H D V G A N N V K ATTTTTCTTAATGGGGAGGATAATCCCAGGTACAATGGACC I F L N G E D N P R Y N G

Figura 07. Sequência de nucleotídeos de parte do cDNA de SBTX amplificado com os primers SBTX 27F1 e AP, juntamente com a sequência de aminoácidos deduzida. O fragmento seqüenciado possui 463 pb. Em negrito está destacado o primer 27F1 desenhado para amplificação. Em azul, aminoácidos da região NH2-terminal da subunidade de 27 kDa da SBTX.

134 Tabela 02. Alinhamentos encontrados para a sequência parcial do cDNA da subunidade de 27 kDa da SBTX utilizando o pacote de algoritmos de busca

BLAST na base de dados do SoyBase (Integrating Genetics and Molecular Biology for Soybean Researchers). A busca foi realizada contra as sequências de EST’s disponíveis para soja. Foram encontradas 29 sequências com escore máximo de alinhamento

Identificador Identidade Expect

>gb|CF806952.1|CF806952 psHB017xO03f USDA- IFAFS:Expression of Phytophthora sojae genes during infection and propagation Glycine max cDNA clone

sHB017O03 5, mRNA sequence

98% 0.0

>gb|BQ740587.1|BQ740587 saq49c07.y1 Gm-c1076 Glycine max cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1076-3181 5' similar to TR:Q39962 Q39962 CITRATE BINDING PROTEIN PRECURSOR. ;, mRNA sequence

98% 0.0

>gb|EH039861.1|EH039861 GMSeed0669 Soybean endosperm tissue in developing seeds Glycine max cDNA clone HYI18.xg_E10_072, mRNA sequence

A Figura 08 mostra o alinhamento da sequência parcial do cDNA encontrada para a toxina com uma das sequências nucleotídicas citadas anteriormente. Com base na alta identidade apresentada entre o cDNA parcial de SBTX e as sequências descritas, pode ser concluído que o cDNA encontrado é, na verdade, parte das sequências depositadas no banco de dados SoyBase, o que tornou possível definir as demais regiões da sequência de nucleotídeos para a cadeia polipeptídica de 27 kDa, obtendo-se assim o cDNA completo de uma das cadeias polipeptídicas da toxina.

O cDNA definido para a cadeia polipeptídica de 27 kDa da SBTX, conforme visualizado na Figura 09 é composto por uma sequência de 815 pares de bases, incluindo uma ORF de 660 nucleotídeos assinalada nas posições 15 a 674, a qual codifica uma cadeia polipeptídica de cerca de 219 resíduos de aminoácidos e massa molecular de 24,570 kDa, valor esse próximo da massa molecular determinada experimentalmente para a cadeia polipeptídica de 27 kDa da SBTX.

136 SBTX --- SC24 TTGGAACTGCAACAATGGTGCCGCAACCCATTTTGCATCTAACCCTTTTGTCATTAATAA 60 SBTX ---CTTTTGGATTTACTCCTT 18 SC24 TCTCTCTGACCACTCTTTCCTTGGTCGATGCCGCCGATCCCACATTTGGCTTCACCCCTC 120 * ***** ** ** *** SBTX TGGGTTTATCTAGTAGCTCAAACTTGCAAATCCAAAAGCCTTACGACGTTGCAGTCAACG 78 SC24 TTGGATTATCTAGTAGCTCAAACTTGCAAATCCAAAAGCCTTACGACGTTGCAGTCAACG 180 * ** ******************************************************* SBTX AGCGCTACAGCTTTTCAAATGGAGTGCACAGATTTTGGGTATACTCCACGGACAAGCCTC 138 SC24 AGCGCTACAGCTTTTCAAATGGAGTGCACAGATTTTGGGTATACTCCACGGACAAGCCTC 240 ************************************************************ SBTX ATATGCAAGGCAGCAATACGAAGCCACGAACTGAGATTCGTATCGCTGGATACGATTATA 198 SC24 ATATGCAAGGCAGCAATACGAAGCCACGAACTGAGATTCGTATCGCTGGATACGATTATA 300 ************************************************************ SBTX CATCCGGTGTGTGGCAATTTCAAGGGTTTTTTTACGTGCCTAGTGGCACAAGCGGGGTGT 258 SC24 CATCCGGTGTGTGGCAATTTCAAGGGTTTTTTTACGTGCCTAGTGGCACAAGCGGGGTGT 360 ************************************************************ SBTX GCATCCAGCAAGTGTTTGGTGGAGTAACTTCTGCCACAACCTCGCAGACTAGGGTCTATG 318 SC24 GCATCCAGCAAGTGTTTGGTGGAGTAACTTCTGCCACAACCTCGCAGACTAGGGTCTATG 420 ************************************************************ SBTX GTGGTTCTCTCACTCATTACCAATCACCTACTCTGGAACCAAACATCTATAATAGGTGGA 378 SC24 GTGGTTCTCTCACTCATTACCAATCACCTACTCTGGAACCAAACATCTATAATAGGTGGA 480 ************************************************************ SBTX TCCGGTTTAACGTGATCCATGATGTGGGTGCCAACAATGTGAAGATTTTTCTTAATGGGG 438 SC24 TCCGGTTTAACGTGATCCATGATGTGGGTGCCAACAATGTGAAGATTTTTCTTAATGGGG 540 ************************************************************ SBTX AGGATAATCCCAGGTACAATGGACC--- 463 SC24 AGGATAATCCCAGGTACAATGGACCTGGCCGTGGAGCCAGCACTCACTACTTCAAGTTTG 600 ************************* SBTX --- SC24 GGGTTTACGCACAGGATGGTGCTTCCAACTACATGGAATCTCGTTGGAGGGATATCCAGA 660 SBTX --- SC24 TTTTTAAAAAATAGAAATGCAGTGCTTTCCTTTCAGTTCCAGGTCTTAATAACACAAGCA 720 SBTX --- SC24 AAGAGCTTGTTTAGTTAACTATATATGACTCTGAATAATTTACTTGGACTGTGAGAAGCA 780 SBTX --- SC24 CGGTTTACAAATAATATAACTCTTGTATTGTGTCT 815

Figura 08. Alinhamento usando o programa Clustal W da sequência parcial do cDNA da subunidade de 27 kDa da SBTX com a sequência de RNAm disponível no NCBI para uma proteína ligante de carboxilatos de soja (SC24). Os asteriscos indicam nucleotídeos idênticos nas duas sequências.

TTGGAACTGCAACAATGGTGCCGCAACCCATTTTGCATCTAACCCTTTTGTCATTAATAATC M V P Q P I L H L T L L S L I I TCTCTGACCACTCTTTCCTTGGTCGATGCCGCCGATCCCACATTTGGCTTCACCCCTCTT S L T T L S L V D A A D P T F G F T P L GGATTATCTAGTAGCTCAAACTTGCAAATCCAAAAGCCTTACGACGTTGCAGTCAACGAG G L S S S S N L Q I Q K P Y D V A V N E CGCTACAGCTTTTCAAATGGAGTGCACAGATTTTGGGTATACTCCACGGACAAGCCTCAT R Y S F S N G V H R F W V Y S T D K P H ATGCAAGGCAGCAATACGAAGCCACGAACTGAGATTCGTATCGCTGGATACGATTATACA M Q G S N T K P R T E I R I A G Y D Y T TCCGGTGTGTGGCAATTTCAAGGGTTTTTTTACGTGCCTAGTGGCACAAGCGGGGTGTGC S G V W Q F Q G F F Y V P S G T S G V C ATCCAGCAAGTGTTTGGTGGAGTAACTTCTGCCACAACCTCGCAGACTAGGGTCTATGGT I Q Q V F G G V T S A T T S Q T R V Y G GGTTCTCTCACTCATTACCAATCACCTACTCTGGAACCAAACATCTATAATAGGTGGATC G S L T H Y Q S P T L E P N I Y N R W I CGGTTTAACGTGATCCATGATGTGGGTGCCAACAATGTGAAGATTTTTCTTAATGGGGAG R F N V I H D V G A N N V K I F L N G E GATAATCCCAGGTACAATGGACCTGGCCGTGGAGCCAGCACTCACTACTTCAAGTTTGGG D N P R Y N G P G R G A S T H Y F K F G GTTTACGCACAGGATGGTGCTTCCAACTACATGGAATCTCGTTGGAGGGATATCCAGATT V Y A Q D G A S N Y M E S R W R D I Q I TTTAAAAAATAGAAATGCAGTGCTTTCCTTTCAGTTCCAGGTCTTAATAACACAAGCAAA F K K - GAGCTTGTTTAGTTAACTATATATGACTCTGAATAATTTACTTGGACTGTGAGAAGCACG GTTTACAAATAATATAACTCTTGTATTGTGTCT

Figura 09. Sequência de nucleotídeos da subunidade de 27 kDa da SBTX, juntamente com a sequência de aminoácidos deduzida para a proteína. A sequência mostrada contém uma ORF delimitada pelos códons de iniciação e parada em destaque (amarelo). A sequência de aminoácidos mostra (em vermelho) resíduos determinados experimentalmente no seqüenciamento NH2-terminal da toxina da soja (44 kDa e 27 kDa).

138 Em adição aos dados já mostrados, uma pesquisa no banco de dados do genoma da soja divulgado recentemente (Dezembro/2008; www.phytozome.net) utilizando a ferramenta Blastn, tendo como entrada a sequência nucleotídeos (ORF) determinada para SBTX 27 kDa, mostrou que o genoma dessa espécie apresenta outras duas sequências gênicas completas (Gm04HSP e Gm06HSP). Essas sequências estão presentes nos cromossomos 04 e 06, respectivamente e mostram elevada identidade quando comparadas com a sequência de entrada, sugerindo que dois genes codificantes para a toxina estão presentes no genoma dessa espécie (Tabela 03).

Tabela 03. Alinhamentos encontrados para a sequência de cDNA da subunidade de 27 kDa da SBTX, utilizando o pacote de algoritmos BLASTn na base de dados do genoma da soja. A busca foi realizada utilizando como entrada a sequência de nucleotídeos codificante (660 pb) da cadeia polipeptídica de SBTX (ORF), que permitiu identificar outras sequências gênicas, cujos produtos apresentaram 85,3 e 95,6% de identidade com a subunidade de 27 kDa da SBTX. No esquema abaixo, são mostradas as posições das sequências encontradas em relação à sequência da SBTX

Identificador Identidade % (positivos/alinhados) Nucleotídeos alinhados Expect Gm04HSP#1 87,7 (342/390) 274-660 3,2e-110 Gm04HSP#2 88,1(238/270) 1- 274 2e-71 Gm06HSP#1 98,2% (380/387) 274 - 660 0 Gm06HSP#2 100% (274/274) 1 - 274 1,4e-152

Tabela 3 – Esquema geral de alinhamento da sequência de SBTX (ORF) com sequências nucleotídicas do genoma da soja

140 Com o objetivo estimar a expressão da sequência de cDNA em plantas de soja em diferentes condições, a sequência nucleotídica da cadeia de 27 kDa foi submetida à busca de sequências idênticas através da ferramenta Blastn contra o banco de EST’s disponível para a soja. Nessa busca foram encontradas 69 EST’s, detectadas em diferentes condições, algumas fisiológicas e outras (maioria) expressas em condições como infecção com patógenos, elicitação com produtos derivados da parede celular de fungos fitopatogênicos e, também, em plantas submetidas a estresses abióticos. Os dados para a freqüência de EST’s encontradas são mostrados (Tabela 04 e 05) em função do local e condição biológica de detecção, bem como em função das cópias dos genes detectados para a toxina.

Tabela 04. Frequência de EST’s para a subunidade de 27 kDa da SBTX detectadas no banco de dados do NCBI, distribuídas em função dos genes definidos para essa proteína Gene Localização no genoma EST’s encontradas (n°/%) Parte do vegetal de detecção mais freqüente Gm06HSP#1 Cromossomo 06 67/97 Cotilédones Gm06HSP#2 Cromossomo 06 2/3 Cotilédones Gm04HSP # 1 e 2 Cromossomo 04 0/0 -

Tabela 05. Frequência de EST’s detectadas para a subunidade de 27 kDa da SBTX no banco de dados do NCBI. Os dados são mostrados como valores absolutos das EST’s encontradas e em função das condições nas quais foram detectadas

Número de EST’s

% do total

Local da planta Condição experimental

29 43,8 Endosperma 40 dias após a floração

17 25,4 Cotilédones de

plântulas

Tratados com glucano elicitor de Phytophthora sojae

2 3 Hipocótilo 48 h após infecção com P. sojae

1 1,4 Cotilédones em

degeneração

Plântulas estioladas 9-10 dias

3 4,4 Hipocótilo, plúmula e sementes

Sementes em germinação

1 1,4 Tecidos adultos -

2 3 Plântulas Infectadas com F. virguliforme (folhas e hipocótilo) 1, 6, 24 e 48 h após

inoculação

1 1,4 Estresse pelo frio: 4°C durante 2 dias

1 1,4 Plântulas Idade de 3 semanas, mantida em casa de

vegetação

2 3 Hipocótilos Infectados com P. sojae e estiolados

2 3 Folhas Estresse com radiação UV-B, 5 dias

2 3 Folhas Tratadas com ozônio

1 1,4 Folhas imaturas Crescidas em campo

1 1,4 Desconhecida Desconhecidas

2 3 Folhas e caules Plântulas infectadas com Pseudomonas, estresse salino e estresse hídrico

142 4.2 Caracterização Físico-Química e Funcional de uma das Subunidades de SBTX com Base nos Dados Obtidos por Clonagem

De posse da sequência completa de aminoácidos e nucleotídeos definidos a partir da clonagem e sequenciamento do cDNA da subunidade de 27 kDa de SBTX, foram avaliados in silico diversos parâmetros físico-químicos atribuídos para a proteína, comparando-os, sempre que possível, com os dados experimentais já obtidos em nosso laboratório.

Tomando como referência os dados mostrados na Figura 09, alguns aspectos devem ser observados com relação à sequência de aminoácidos deduzida. Primeiramente, a sequência mostra os resíduos de aminoácidos da extremidade NH2-terminal determinados

para a subunidade de 27 kDa da SBTX, mas em posições mais internas da cadeia polipeptídica (resíduos destacados em vermelho). Dessa forma, os demais 26 resíduos de aminoácidos anteriores ao NH2-terminal da molécula, poderiam representar um peptídeo

sinal de endereçamento da proteína. Através do uso da ferramenta SignalP 3.0 (www.expasy.ch) foi identificado um sítio de clivagem para um peptídeo sinal entre os resíduos de aminoácidos 26 e 27 da cadeia polipeptídica (Figura 10).

A composição de aminoácidos da subunidade de 27 kDa da SBTX também mostra um resíduo de cisteína que está provavelmente envolvido na interação por pontes dissulfeto com a outra cadeia polipeptídica que constitui a proteína nativa de 44 kDa. Em adição, outras características determinadas in silico para a sequência de aminoácidos deduzida da subunidade de 27 kDa da SBTX também foram obtidas experimentalmente. A Tabela 06 mostra que a massa molecular, ponto isoelétrico básico e percentual de cisteína na composição de aminoácidos da proteína total são parâmetros praticamente idênticos entre os valores teóricos e determinados em laboratório. Outras características bioquímicas também são mostradas, como número de resíduos de aminoácidos na cadeia polipeptídica e número de resíduos ácidos e básicos.

Figura 10. Diagrama da sequência NH2-terminal da subunidade de 27 kDa da SBTX, mostrando sítios de clivagem preditos para a proteína na obtenção do peptídeo sinal. O sítio de clivagem mais provável está entre os aminoácidos 26 e 27, tal como observado no traçado do gráfico (linha vermelha de maior altura).

144 Tabela 06. Parâmetros físico-químicos determinados para a subunidade de 27 kDa da SBTX com base na sequência de aminoácidos deduzida. Os dados foram obtidos a partir de análise in silico usando a ferramenta Compute pI/Mw, disponível em www.expasy.ch. Em paralelo, são mostradas as características experimentais determinadas para a toxina da soja

a_{Resíduos de aminoácidos da proteína não processada.}

b_{Resíduos de aminoácidos da proteína processada.}

Parâmetro In silico Experimental Referência

Resíduos de aminoácidos 219

a

193b - -

Massa Molecular 21,785 kDa

Espectrometria de

massas: 21,604 kDa Siebra, 2004

Ponto isoelétrico 9,3 8,4 Siebra, 2004

Asp + Glu 13 ND -

Arg + Lys 18 ND -

A Figura 11 mostra que na sequência de aminoácidos da subunidade de 27 kDa da SBTX, também podem ser identificados sítios de fosforilação e glicosilação. Foram preditos cerca de 06 resíduos de serina, 04 de tirosina e 01 de treonina potencialmente fosforilados. Também foi detectada uma região na sequência – QSPTLEPN – contendo um resíduo de treonina como sítio para O-glicosilação com monossacarídeos tipo mucina