2.3 Resultados e Discussão
2.3.4 Isolamento do patógeno e testes de identificação
A partir do processo de deslintamento foi possível isolar colônias bacterianas com características de morfologia e coloração amarela semelhantes à X. citri subsp.
malvacearum em três das quatro amostras testadas. Em uma das amostras não foi
possível o isolamento do patógeno, provavelmente devido à presença do grande número de micro-organismos contaminantes presentes no material.
As colônias características de X. citri subsp. malvacearum foram selecionadas para os testes de coloração de Gram, hidrólise de amido e testes de hipersensibilidade em folhas de fumo e tomateiro.
2.3.5 Reação de Gram e teste de hidrólise de amido
A partir do esfregaço das colônias bacterianas em lâminas contendo gotas de KOH, foi possível confirmar que todas as colônias selecionadas eram Gram-negativas. Bactérias Gram-negativas tornam-se viscosas, aderentes à alça de platina, formando um fio contínuo, enquanto que as Gram-positivas permanecem não viscosas e não formam fio de aderência. A viscosidade obtida nas células Gram-negativas deveu-se à dissolução da parede celular e consequente liberação de DNA bacteriano.
Posteriormente, as colônias obtidas no isolamento foram testadas para hidrólise de amido, uma vez que X. citri subsp. malvacearum apresenta resultado positivo para esse teste. A adição de solução de lugol às placas de Petri em que as bactérias foram cultivadas permitiu a visualização de halo claro ao redor de todas as colônias, indicando a hidrólise do amido, reagente presente no meio de cultura (Figura 5).
Figura 5 – X. citri. subsp. malvacearum em placa de Petri. A. Colônias obtidas do isolamento a partir das amostras de sementes crescidas em meio de cultura com amido. B. Formação de halo translúcido ao redor das colônias, observada após a adição de lugol sobre superfície do meio
2.3.6 Teste de reação de hipersensibilidade
As reações de hipersensibilidade (HR) em folhas de tomateiro e fumo com as linhagens selecionadas no isolamento apresentaram resultado positivo para todas as colônias testadas. Esse teste foi muito útil para a confirmação da patogenicidade dos isolados obtidos, uma vez que somente espécies fitopatogênicas têm a capacidade de induzir esse tipo de resposta, enquanto que bactérias saprofíticas não induzem HR. Além disso, esse teste foi rápido e de fácil interpretação.
2.3.7 Testes de patogenicidade em plantas de algodoeiro
Quatro linhagens obtidas no isolamento foram selecionadas para os testes de patogenicidade em plantas de algodoeiro que foram efetuados pelo método de infiltração nas folhas. Após cerca de 21 dias da inoculação, observou-se o aparecimento de anasarca (tecido encharcado) nas áreas infiltradas com a suspensão bacteriana. Do material vegetal apresentando sintomas característicos da doença foi efetuado o reisolamento do patógeno.
A identificação dos isolados como X. citri subsp. malvacearum foi confirmada por meio da amplificação com os primers específicos desenhados e posterior sequenciamento do fragmento obtido. As linhagens foram incorporadas à Coleção de
Culturas de Fitobactérias do Instituto Biológico (IBSBF), sob os números IBSBF 2530, IBSBF 2531, IBSBF 2532 e IBSBF 2533.
2.3.8 Detecção do patógeno por PCR, BIO-PCR e nested-PCR
Inicialmente foram efetuadas amplificações partindo-se de alíquotas retiradas diretamente do material resultante da extração do patógeno das sementes utilizando-se os primers específicos xam1F/2R. Entretanto, não foi observada amplificação em nenhuma das amostras testadas. Este resultado pode ser justificado pela presença de inibidores da PCR, como compostos fenólicos ou outras substâncias químicas (AUDY et al., 1996).
Uma vez que a técnica de PCR permite a amplificação do DNA proveniente tanto de células viáveis quanto de células não viáveis, decidiu-se empregar a técnica de enriquecimento antes do processo de amplificação a fim de aumentar o número de células presentes na solução de extração do patógeno. Para que a BIO-PCR seja bem sucedida, é necessário que o meio de cultura permita o crescimento da bactéria de interesse ao mesmo tempo em que suprima o dos demais micro-organismos presentes na amostra. Além de proporcionar um considerável aumento no nível de detecção, confirmado posteriormente na leitura do gel de agarose, o procedimento de enriquecimento ainda ajuda a reduzir a presença de inibidores da reação da polimerase em cadeia (SONG et al., 2004; SCHAAD et al., 1995; SCHAAD et al., 2003).
No presente estudo, o enriquecimento foi efetuado em meio de cultura líquido por aproximadamente 24 horas e após esse período foram efetuadas as amplificações empregando-se os primers xam1F/2R. Como resultado, além da observação do fragmento esperado de 560 pb, também foram verificadas várias bandas inespecíficas em todas as amostras analisadas.
Diante dos dados obtidos, optou-se pela combinação das técnicas de BIO-PCR e
nested-PCR, utilizando-se na primeira etapa de amplificação os primers
correspondentes à parte do gene rpoB (rpoB2F/3R) e na segunda etapa os primers xam1F/2R. No primeiro experimento, foi possível a observação de uma única banda de peso molecular de 800 pb, correspondente ao fragmento de parte do gene rpoB. Como
controle positivo das amplificações, utilizou-se 200 ng do DNA genômico da linhagem de X. citri subsp. malvacearum (IBSBF 1733P) (Figura 6).
A adição de um segundo passo de amplificação aumenta a sensibilidade do protocolo. Isso porque nenhum amplicon não específico produzido pela amplificação anterior atua como molde para a amplificação seguinte. Para o experimento de BIO- PCR/nested-PCR, foram utilizados 1,0 µL dos produtos da amplificação de parte do gene rpoB como molde. O resultado obtido foi uma banda de aproximadamente 560 pb, correspondente ao tamanho do fragmento específico de interesse, para todas as amostras testadas, incluindo na amostra em que não foi possível isolar o patógeno em placas de meio de cultura (Figura 7).
Figura 6 - Amplificação por BIO-PCR/nested-PCR para parte do gene rpoB. (M) Marcador molecular de 100 pb (Fermentas); (1 a 6) Amostras provenientes do material resultante do processo de extração do patógeno; (7) DNA genômico (200 ng) de X. citri subsp. malvacearum (IBSBF 1733P) (controle positivo da reação)
M 1 2 3 4 5 6 7
Figura - 7 Amplificação por BIO-PCR/nested-PCR com primers específicos para Xcm. (1 a 6) Produto da BIO-PCR/nested- PCR; (7) DNA da linhagem IBSBF 1733P,como controle positivo; (8) água, como controle negativo
Embora a PCR seja uma técnica altamente sensível, ela não permite a diferenciação entre células viáveis e células não viáveis. Essa limitação é um dos fatores que dificulta a aplicação da PCR em laboratórios de quarentena. No método desenvolvido por Sakthivel, Mortensen e Marthur (2001) para a detecção de
Xanthomonas oryzae pv. oryzae em sementes e em plantas de arroz, essa limitação
pôde ser solucionada com o emprego da BIO-PCR, que consistiu no plaqueamento das sementes ou de extratos obtidos das mesmas antes da reação de PCR, utilizando-se uma suspensão das células bacterianas obtidas como molde para a reação. Os autores concluíram que o método eliminou tanto o problema de resultados falso-negativos devido à presença de inibidores da PCR em plantas ou em extratos de sementes, quanto o de falso-positivos resultantes da presença de células não viáveis.
No trabalho de Song et al. (2004) que descreve a detecção de Acidovorax
avenae subsp. avenae em sementes de arroz, os autores verificaram que os resultados
obtidos de amostras de sementes sem enriquecimento variaram consideravelmente, apontando a necessidade do passo do enriquecimento para se obter reprodutibilidade nos resultados e um grau mais elevado de sensibilidade da técnica. Os autores afirmaram que a BIO-PCR foi uma valiosa ferramenta não só para fins de detecção do
560 pb ___
patógeno como também para monitorar a ocorrência natural da bactéria e estudar a localização do patógeno no campo. A análise completa do lote de sementes pôde ser concluída num intervalo de 2 a 3 dias, enquanto que utilizando-se os métodos convencionais, o processo se encerrava em um prazo que variava de 10 a 14 dias.
Uma das vantagens em se utilizar o processo de nested-PCR consiste no considerável aumento da sensibilidade do protocolo, além de tornar possível a detecção do patógeno em extratos, macerados ou embriões de sementes. Além disso, o procedimento de extração do patógeno das sementes por simples lavagem não é destrutivo e não há necessidade da extração do DNA antes de se processar as sementes (VERDIER; OJEDA; MOSQUEDA, 2001).
Robène-Soustrade e colaboradores (2006) desenvolveram um teste baseado na técnica de nested-PCR para a detecção de X. axonopodis pv. dieffenbachiae, agente causal do crestamento bacteriano em antúrio. Com a inclusão do segundo passo de amplificação (nested-PCR), o nível de detecção obtido com culturas puras e extratos de plantas foi de 103 ufc/mL, o que permitiu a detecção do patógeno a partir de plantas contaminadas 12 dias antes do aparecimento dos sintomas. Esses resultados demonstraram que métodos baseados em nested-PCR podem ser uma ferramenta de diagnose útil para a certificação de material de propagação em viveiros e para a vigilância fitossanitária internacional.
Num estudo para a detecção de Pseudomonas syringae pv. phaseolicola em sementes de feijão, Schaad et al. (1995), otimizaram um método já descrito por eles adicionando um passo de plaqueamento da suspensão bacteriana em ágar. Após o plaqueamento, lavou-se a superfície do meio e procedeu-se à primeira amplificação diretamente deste material. Em seguida, um par de primers diferente foi utilizado para a segunda amplificação. Com isso, conseguiu-se reduzir e, por vezes, eliminar, a amplificação de DNA de células não viáveis, além de remover os inibidores de PCR, que poderiam estar presentes nas amostras de sementes. O aprimoramento dessa metodologia proporcionou o aumento da sensibilidade de detecção de Pseudomonas
syringae pv. phaseolicola em lotes de sementes com baixos níveis de contaminação,
Xanthomonas citri subsp. malvacearum pode ser disseminada no campo por
meio de eventos climáticos ou práticas culturais, mas a introdução do patógeno em novas áreas de cultivo de algodoeiro é devida, principalmente, à utilização de sementes contaminadas. Uma vez que as sementes contaminadas podem ser distribuídas aleatoriamente no campo, estas se tornam fonte primária de inóculo da doença. Sabendo-se da importância de se preservar áreas de plantio indenes à mancha angular do algodoeiro, procurou-se desenvolver uma metodologia baseada em técnicas moleculares que permitissem a detecção e identificação do patógeno causador dessa doença. Os primers desenhados neste estudo mostraram-se altamente específicos para a X. citri pv. malvacearum e foram utilizados em ensaios de BIO-PCR/nested-PCR em análises de sementes de algodoeiro sabidamente contaminadas, possibilitando a detecção e identificação do patógeno, evitando, assim, as etapas laboriosas de isolamento em meios de cultura semi-seletivos e identificação por métodos bioquímicos convencionais.
3 CONCLUSÕES
• o par de primers xam1F/2R mostraram-se altamente específicos na detecção e identificação de Xanthomonas citri subsp. malvacearum;
• o nível de detecção dos primers xam1F/2R utilizando-se suspensões de cultura pura de X. citri subsp. malvacearum foi de 8 ufc/ 5,0 µL e de 1,0 ng do DNA genômico da bactéria;
• a combinação das técnicas de BIO-PCR e nested-PCR possibilitou a detecção e identificação do patógeno em amostras de sementes de algodoeiro;
• a metodologia desenvolvida neste estudo permitiu a detecção do patógeno mesmo na amostra em que não foi possível isolar o patógeno em meio de cultura.
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