ISOLAMENTO E CONSERVAÇÃO DE LEVEDURAS

4.4 ISOLAMENTO E CONSERVAÇÃO DE LEVEDURAS

As uvas coletadas do estado do Paraná (FIGURA 8, a) foram removidas dos cachos e esmagadas dentro de sacos plásticos desinfetados com álcool 70%, com o auxílio de luvas estéreis, resultando em mosto de uva.

Foram transferidos cerca de 200 mL do mosto de uva para frascos de Erlenmeyer de 500 mL de capacidade (FIGURA 8, b), os quais foram mantidos em estufa microbiológica Fabbe BOD Tecnal^® TE-391 a 24 °C até o término da fermentação espontânea.

Diariamente, amostras de cada frasco foram coletadas e diluídas em uma série de tubos de diluição (FIGURA 8, c), e em seguida, amostras de todas as diluições foram inoculadas na superfície de placas de Petri contendo meio sólido YPG (pH 4,5) e distribuídas pelo método de espalhamento utilizando alça de Drigalski estéril, em ambiente estéril da cabine do fluxo laminar TROX do Brasil^® FLV classe I (FIGURA 8, d). As placas com meio inoculadas foram deixadas em estufa a 28 °C durante até 72 horas.

As colônias isoladas com características macroscópicas de leveduras (FIGURA 8, e) foram transferidas com o auxílio de uma alça bacteriológica estéril para tubos contendo meio sólido YPG (pH 5,2) e estes foram mantidos em estufa a 28 °C durante até 72 horas (FIGURA 8, f).

Após a visualização do crescimento celular, transferiu-se uma alçada de células para um frasco de Erlenmeyer de 25 mL de capacidade contendo 5 mL de meio líquido YPG (pH 5,2). Os frascos inoculados foram colocados em incubadora refrigerada com agitação Tecnal^® TE-421 a 28 °C, 150 rpm, durante 24 horas (FIGURA 8, g).

Em seguida, verificou-se a ausência de contaminantes no cultivo e as características morfológicas microscópicas de levedura por técnica a fresco, conforme descrito por TORTORA; FUNKE e CASE (2012) utilizando microscópio ótico Olympus^® CX 41 (FIGURA 8, h).

Um volume de 1 mL do cultivo foi transferido para frasco de Erlenmeyer de 50 mL de capacidade contendo 10 mL de meio líquido YM (pH 5,2). Os frascos inoculados foram colocados em agitador-incubador a 28 °C, 150 rpm. Após 24 horas,

!

um volume de 5 mL de cultivo foi transferido para frasco de Erlenmeyer de 250 mL de capacidade contendo 50 mL de meio líquido YM (pH 5,2) (FIGURA 8, i). Os frascos inoculados foram colocados em agitador-incubador a 28 °C, 150 rpm, durante até 24 horas.

Após a verificação do crescimento de cada levedura isolada, as células foram separadas do restante do cultivo por centrifugação (Centrífuga Sigma^® 1-14) a 300 xg (FIGURA 8, j), e o sobrenadante foi substituído por 800 µL de meio líquido YM (pH 5,2) e 200 µL de glicerol. Os frascos de polipropileno contendo as células de levedura foram mantidos em freezer Cônsul^® a - 20 °C (FIGURA 8 , k).

A nomenclatura para as leveduras isoladas foi realizada utilizando as letras e números da uva que foram isoladas (CB1, AT1, AT2, AT3, CL1 ou CL2), seguido do dia da fermentação espontânea (0 a 9), número da placa de Petri que foram semeadas (dois dígitos numéricos) e o número da posição em que a colônia se desenvolveu na placa (dois dígitos numéricos, de 00 a 99).

58!

!

FIGURA 8 - ISOLAMENTO E CONSERVAÇÃO DE LEVEDURAS AUTÓCTONES

FONTE: O autor (2016). !

NOTA: Representação esquemática do procedimento realizado para isolamento e conservação de leveduras provenientes de uvas cultivadas no estado do Paraná.

a. Uvas coletadas do estado do Paraná

e. Obtenção de colônias com diferentes morfologias

macroscópicas c. Diluição

seriada b. Fermentação

espontânea d. Cultivo em meio

sólido YPG (pH 4,5)

f. Semeadura das colônias isoladas em meio sólido

YPG (pH 5,2)

g. Crescimento em meio líquido YPG h. Visualização das

características microscópicas de levedura e ausência de

contaminantes i. Crescimento da cultura

pura de cada levedura em meio líquido YM (pH 5,2) k. Adição de meio líquido

YM (pH 5,2) e glicerol.

Conservação a - 20 °C

j. Separação das células

recém-crescidas

!

4.5 SELEÇÃO DAS LEVEDURAS ISOLADAS PRODUTORAS DA ENZIMA β-GLICOSIDASE

Nos ensaios para detectar a presença da enzima β-glicosidase nas leveduras isoladas, foram empregadas as leveduras Candida wickerhamii NRRL Y-2563 e Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12632 como referências. As leveduras foram adquiridas da ARS Culture Collection e ativadas de acordo com as instruções recebidas juntamente com os micro-organismos. Após ativação e crescimento, as leveduras foram conservadas (ver 4.4).

Cada uma das 308 leveduras isoladas e as leveduras referência, conservadas por congelamento, foram descongeladas, homogeneizadas e semeadas em meio sólido YM inclinado (pH 5,5) contido em tubos, os quais foram mantidos na temperatura de 28 °C durante até 72 horas. Após verificar o crescimento das células de cada levedura, estas foram removidas do meio sólido com o auxílio de uma alça bacteriológica e suspensas em água destilada estéril. A suspensão de células de cada levedura foi empregada como inóculo nos ensaios para verificar a presença da enzima β-glicosidase.

Primeiramente, as leveduras isoladas foram investigadas quanto à sua capacidade de crescer na presença de celobiose como única fonte de carbono. Com o auxílio de uma alça bacteriológica calibrada, um volume de 10 µL de suspensão de cada levedura, isoladas e controles, foi semeado em placas de Petri contendo o meio YNB 6,7 g.L^-1 adicionado de celobiose (Sigma-Aldrich^®, SP, Brasil) 10 g.L^-1 e ágar 20 g.L^-1 (pH 5,5). Concomitantemente, as suspensões das leveduras isoladas e controles também foram semeadas em placas de Petri contendo meio sólido YM (pH 5,5). As placas de Petri semeadas foram mantidas na temperatura de 28 °C durante até 72 horas.

A presença da enzima β-glicosidase em cada levedura isolada e nas leveduras Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12632 e Candida wickerhamii NRRL Y-2563 também foi avaliada utilizando os substratos esculin e arbutin como única fonte de carbono no meio de cultivo. Um volume de 200 µL de suspensão de cada levedura, isoladas e controles, foi inoculado em frascos de Erlenmeyer de 50 mL de capacidade contendo 5 mL de meio YNB 6,7 g.L^-1 adicionado de arbutin (Sigma-Aldrich^®, SP, Brasil) 0,75 g.L^-1 e citrato férrico (Merck^®, SP, Brasil) 0,1 g.L^-1 (pH 5,5) e em meio YNB 6,7 g.L^-1 adicionado de esculin (Sigma-Aldrich^®, SP, Brasil)

60!

!

0,94 g.L^-1 e citrato férrico 0,1 g.L^-1 (pH 5,5). Para a adição do citrato férrico, foi preparada uma solução de citrato férrico 1% que foi esterilizada separadamente e adicionada quando os meios estavam na temperatura ambiente (GAENSLY et al., 2014). Um volume de 200 µL de suspensão de cada uma das leveduras, isoladas e controles, também foi transferido para frascos de Erlenmeyer de 50 mL de capacidade contendo 5 mL de meio líquido YM (pH 5,5). Os fracos de Erlenmeyer inoculados foram mantidos em agitador-incubador a 28 °C, 150 rpm, durante 48 horas. Os ensaios que utilizaram como única fonte de carbono os substratos arbutin ou esculin foram interpretados de acordo com a mudança de coloração do meio de cultivo.

4.6 IDENTIFICAÇÃO DAS LEVEDURAS ISOLADAS PRODUTORAS DA