Isolamento viral

Amostras de sêmen que apresentaram Ct. abaixo de 35 foram submetidas a isolamento viral utilizando primeiramente células KC. Como não há relato na literatura sobre isolamento viral nessas células utilizando sêmen como material biológico, foram inicialmente testadas diferentes diluições do sêmen. Na tabela 3.10, podemos analisar o cultivo em células KC de culicoides utilizando 12 amostras de sêmen em diferentes diluições. Em algumas amostras ocorreu a morte celular em 24 horas, enquanto para outras, com a mesma diluição, houve adesão celular, evidenciando baixa citotoxicidade. A concentração espermática foi ajustada para 106células espermáticas /500 µL (quantidade de célula espermática utilizada na inseminação artificial). Consequentemente a quantidade de PBS utilizada para diluir as mesmas foi variável, fator que pode ter contribuído para a citotoxidade e morte celular.

Para a amostra de número 5, por exemplo, a concentração espermática inicial estava muito baixa e a quantidade de diluente utilizado foi menor, portanto a concentração do plasma seminal estava maior do que em outras amostras testadas. Foi testado o isolamento viral somente utilizando o plasma seminal sem diluição e as células tornaram-se inviáveis em 24 horas. O sucesso ou não do isolamento viral para amostra de sêmen está diretamente relacionado à concentração espermática inicial e, consequentemente, ao volume de diluente utilizado, lembrando que o plasma seminal possui uma grande quantidade de lipídeos, proteínas e sais, que dificulta ainda mais o isolamento viral em célula. Fiore (1997), também observou a citotoxidade do plasma seminal em cultura de linfócitos e também relatou que a presença de SFB aumenta ainda mais a citotoxidade celular.

Como pode ser observado na tabela 3.10, amostras que foram pouco diluídas com PBS após a contagem espermática apresentaram morte celular em 24h, enquanto amostras com a quantidade maior de diluente obtiveram maior sucesso no isolamento viral. Nesse sentido, amostras de sêmen foram coletadas de touros de diferentes idades, com comprimento, largura, volume e circunferência escrotal que variam amplamente entre os animais coletados e consequentemente, a quantidade de material coletado. Argov-Argaman e colaboradores (2013) encontraram uma diferença na concentração de lipídeos de acordo com a idade do touro. Touros maduros possuem uma menor concentração de lipídeo no sêmen. Amostras biológicas com alto teor de lipídeos, quando adicionadas ao cultivo celular, geralmente causam citotoxicidade. Esse fator pode explicar a diferença de citotoxidade encontrado nesse trabalho para as diferentes amostras de sêmen.

Tabela 3.10 Análise da citotoxicidade celular e valor de Ct. na qRT-PCR seg-9.

Amostra 905 405 78 444

diluição _{s/diluir 1:5 s/diluir 1:5 s/diluir 1:5 s/diluir 1:5}

24H AC AC AC AC AC AC AC AC

48H MC MC AC AC AC AC AC AC

Ct. KC2 S/Ct. S/Ct. S/Ct. S/Ct. S/Ct. S/Ct.

Ct. KC3 S/Ct. S/Ct. 38.51 S/Ct. S/Ct. S/Ct.

Amostra 886 896

diluição s/diluir 1:5 1:10 1:20 s/diluir 1:5 1:10 1:20

24H MC MC MC AC MC MC AC AC

48H AC AC AC

Ct. KC2 S/Ct. S/Ct. S/Ct.

Ct. KC3 S/Ct. S/Ct. S/Ct.

Amostra 4 5

diluição s/diluir 1:5 1:10 1:20 s/diluir* 1:5 1:10 1:20

24H MC MC AC AC MC MC MC AC

48H MC MC MC

Amostra Holandês S/brinco HPB/PS HVB01

diluição 1:5 1:5 1:5 1:5

24H AC AC AC AC

48H MC MC AC AC

Ct. KC2 37.61 36.99

Ct. KC3 34.54 34.22

AC- Baixa Adesão Celular; AC- Alta Adesão Celular; MC-Morte celular; *Adicionado somente plasma seminal; KC2: Segunda passagem; KC3: Terceira passagem; Ct.: Valor do Ct. em qRT-PCR seg-9.

Posteriormente à primeira passagem, as amostras que permaneceram viáveis durante sete dias foram submetidas a uma segunda passagem em célula KC (KC2). Após passado o tempo de incubação de sete dias, as células foram coletas e submetidas a uma terceira passagem em células KC (KC3). Foi realizado também a extração de RNA com robô KingFisher e a qRT- PCR utilizando iniciadores para o seg-9 para acompanhar a multiplicação viral. O mesmo procedimento ocorreu depois de passado o tempo de incubação da terceira passagem. Nesta etapa o seg-9 foi utilizado somente para avaliar a positividade das amostras, não tendo o mesmo potencial para a tipagem. Este segmento é o utilizado normalmente para este fim no Instituto Pirbright. Diferentemente, para a avaliação das amostras de sêmen diretamente (item 5.2) foi utilizado o seg-10 (codificador da NS3), unicamente porque no Brasil o sêmen havia sido testado com o mesmo, e facilitaria as análises comparativas.

Somente duas amostras apresentaram Ct. menor que 35 na terceira passagem e elas foram submetidas a uma quarta passagem em células KC (KC4) e depois, foram iniciadas as passagens em células de mamífero. A primeira célula utilizada foi a BHK-21. Foram realizadas três passagens nessas células utilizando KC3 como inóculo inicial e também foi realizada passagem em células VERO. Todas as passagens em cultivo de células realizadas foram submetidas à extração de RNA utilizando o robô KingFisher e, posteriormente, foi realizada a qRT-PCR utilizando o seg-9. Os resultados podem ser observados na figura 3.8.

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Figura 3.8: Comparação do valor do Ct. na qRT-PCR (seg-9) para amostras que foram cultivadas em célula de inseto (KC) e células de mamíferos BHK-21 e VERO. As barras azuis representam

amostra do sêmen do touro HPB/PS com suas passagens em célula e as barras roxas representam o amostra do sêmen do animal HVB01, ambos da cidade de Pedro Leopoldo. Houve diminuição do valor de Ct. nas passagens em células de inseto KC, e em uma amostra (HPB/PS) também houve diminuição do valor de Ct. em célula BHK-21.

Como pode ser observado, o valor de Ct. foi diminuindo com as passagens em células KC para ambos os isolados, sugerindo multiplicação viral em passagens subsequentes. O mesmo não foi observado nas passagens em células de mamíferos. Para o isolado HPB/PS pode-se observar uma diminuição no valor de Ct. nas passagens em células de mamífero BHK-21, mas o mesmo não foi observado com o isolado HVB01. Foi realizado somente uma passagem em células VERO. Nenhuma amostra apresentou ECP na monocamada celular.