Mecanismo de ação molecular do fipronil.
IV MATERIAL E MÉTODOS
1. Animais: para o desenvolvimento deste trabalho foram utilizados 120 ratos Wistar jovens (45-50 dias de idade), machos, fornecidos pelo Biotério Central da Unesp de Botucatu. Os animais foram mantidos no Biotério do Centro de Assistência Toxicológica (CEATOX) sob condições padrão (temperatura controlada a 22±2°C, luz 12x12 horas, umidade 70-80%, água e ração ad libitum) para aclimatação e crescimento, até o momento de sua utilização nos experimentos. O projeto foi aprovado pela Câmara de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP de Botucatu.
2. Drogas utilizadas
⇒ Fipronil: Frontline® (Merial Saúde Animal Ltda – São Paulo, Brasil);
⇒ Diazepam: Dienpax® - ampolas medicamentosas contendo diazepam
10mg/2mL (Sanofi-Syntelabo).
⇒ Flumazenil (Roche Diagnostics GmbH – Rio de Janeiro, Brasil) – Lote BS9911SA01.
3. Procedimento Experimental
3.1. Experimento piloto: obtenção da dose de fipronil e o tempo esperado para o aparecimento de efeito a serem utilizados nos experimentos. Para encontrar a dose ideal para ser utilizada neste trabalho, realizou-se um experimento piloto baseando-se no trabalho de OHI et al. (2004), os quais utilizaram o fipronil nas doses de 70, 140 e 280 mg/kg e observaram que nestas doses o mesmo provocava efeitos reprodutivos adversos. Estas três doses foram testadas em grupos de 10 animais cada uma comparando-se com um grupo controle, também de 10 animais. A maior dose que causou efeito comportamental nos animais foi a de 280 mg/kg e esta foi a dose escolhida para ser utilizada nos experimentos.
Trinta animais foram divididos em 3 grupos (n=10) e foram testados os tempos de 1, 2 e 4 horas após a aplicação tópica do fipronil, para o aparecimento de efeito sobre o comportamento. Escolheu-se o tempo de 3,5 horas.
3.2. Grupos de tratamento (N=15): experimento para testar a influência do diazepam e do flumazenil sobre os efeitos comportamentais do fipronil:
- Controle (CT): os animais receberam apenas manipulação de forma idêntica aos tratados, administrando-se topicamente numa única vez sobre o seu dorso, apenas óleo de milho (0,3ml).
- Grupo fipronil (F): os animais receberam fipronil na dose de 280 mg/kg, aplicado topicamente, sobre o seu dorso (0,25 – 0,3ml)
- Grupo fipronil mais diazepam (F+DZ): os animais receberam fipronil na dose de 280 mg/kg, aplicado topicamente sobre o seu dorso. Após 3 horas da aplicação de fipronil, foi administrado diazepam, na dose de 5 mg/kg, por via intraperitoneal (ip).
- Grupo fipronil mais flumazenil (F+FZ): os animais receberam fipronil na dose de 280 mg/kg, aplicado topicamente, sobre o seu dorso. Após 3 horas da aplicação de fipronil foi administrado flumazenil, na dose de 4 mg/kg, por via intraperitoneal (ip).
Após 3 horas da aplicação do óleo de milho ou do fipronil e após 30 minutos da aplicação do diazepam ou do flumazenil, o comportamento dos animais de todos os grupos de tratamento foi avaliado em Arena de Campo Aberto e Labirinto em Cruz Elevado.
0 3,0 3,5 h
Figura 4 - Esquema do protocolo experimental para administração dos agentes químicos.
3.3. Avaliação Neurocomportamental
3.3.1. Arena de Campo Aberto: a atividade geral dos animais foi avaliada por meio de observação direta em arena de campo aberto, construída conforme especificações modificadas por Broadhurst (1960). Para as observações comportamentais, os animais foram colocados no centro da arena e, durante 3 minutos, foram registrados os parâmetros descritos a seguir:
Congelamento: tempo, em segundos, em que o animal permanece em imobilidade tônica, geralmente com o ventre rente ao chão, os olhos bem abertos e respiração irregular.
Limpeza: tempo, em segundos, em que o animal executa movimentos com as patas anteriores em direção aos pavilhões auriculares e/ou movimentos de lamber dirigidos, principalmente, às porções laterais do corpo e região genital; Locomoção: número de vezes em que o animal adentra com as quatro patas em uma das divisões da arena;
Levantar: número de vezes em que o animal se coloca sobre as patas traseiras, com o tronco perpendicular à arena, tendo a cabeça dirigida para cima e, tocando ou não com as patas anteriores, as paredes do campo aberto;
Óleo de milho ou Fipronil Diazepam ou Flumazenil
Avaliação
Comportamental
I.p. Tópico3.3.2. Labirinto em Cruz Elevado: este teste comportamental foi descrito por Pellow e Chopin (1985), e convalidado por Pellow e File (1986), para o estudo de drogas ansiolíticas e ansiogênicas em ratos. Este teste fundamenta-se na aversão dos roedores a espaços abertos e altos, o que acarreta estimulação tanto dos centros do medo como da exploração, sendo interpretado como indutor da ansiedade. O aparelho consiste em um labirinto em cruz, com dois braços fechados (50x10x40 cm), e este elevado a 50 cm do chão. Os animais foram colocados no espaço central do labirinto com a cabeça voltada para o espaço aberto e serão registrados o número de vezes e o tempo em segundos em que o animal entra e permanece nos braços abertos e fechados, a cada minuto, durante 5 minutos.
O índice de ansiedade corresponde à razão entre o número de entradas nos braços abertos e o número total de entradas. Este índice é diretamente proporcional ao efeito ansiolítico do animal (PELLOW e CHOPIN, 1985).
Ao final de cada sessão, na arena e no labirinto, os aparelhos foram limpos com álcool etílico 5%, v/v para disfarçar o cheiro do animal anterior.
4. Análise Estatística dos Resultados
Os resultados experimentais obtidos em cada grupo de tratamento foram comparados estatisticamente por meio do programa INSTAT 3.0 (GraghPad Software) utilizando-se análise de variância (ANOVA) complementada, a
posteriori, com o teste de Tukey-Kramer sempre que encontrado p<0,05
(SNEDECOR e COCHRAN, 1980). Os grupos controle e fipronil foram comparados, em separado, com fipronil mais diazepam ou fipronil mais flumazenil.
V – RESULTADOS
A tabela 1 e os gráficos de 1 a 4, contêm os resultados da avaliação comportamental realizada em Arena e Campo Aberto.
Tabela 1 – Resultados da avaliação comportamental realizada em Arena de Campo Aberto em animais controle e recebendo fipronil, fipronil mais diazepam e fipronil mais flumazenil.
Comportamento Grupos Experimentais Controle Fipronil Fipronil +
Diazepam Flumazenil Fipronil +
Congelamento (s) ±1,24 2,79 ±1,31 4,34 ±1,72 ** 15,29 * ±0,52 1,37 Limpeza (s) ±0,60 6,69 13,06 * ±3,14 ±0,09 ** 0,53 * ±2,34 ** 21,74 * Locomoção (no.) 52,15 ±2,47 49,50 ±3,16 ±5,91 ** 28,16 * 48,10 ±3,54 Levantar (no.) ±0,31 1,62 7,07 * ±0,74 3,20 ** ±0,84 ±0,82 ** 12,27 *
Os valores representam a Média ± Erro Padrão da Média. *p<0,05 do Controle **p<0,05 do Fipronil (Tukey-Kramer).
Gráfico 1 - Comportamento de congelamento em ratos controles agudamente ao fipronil, fipronil mais diazepam e fipronil mais flumazenil (N=15).
CT F F + DZ F + FZ 0 5 10 15 20
***
Te m po ( se g. )Os valores representam a Média ± Erro Padrão da Média. CT = Controle F = Fipronil DZ = Diazepam FZ = Flumazenil *p<0,05 do Controle **p<0,05 do Fipronil (Tukey-Kramer).
No gráfico 1, observa-se que administração de fipronil provocou um aumento (55%), estatisticamente não significante, no comportamento de congelamento dos animais em relação ao controle. Administração de fipronil mais diazepam provocou um aumento estatisticamente significante do comportamento de congelamento, em relação ao controle e em relação ao fipronil. A administração de fipronil mais flumazenil provocou uma diminuição estatisticamente não significante do comportamento de congelamento, em relação ao controle (51%) e ao fipronil (68%).
Gráfico 2 - Comportamento de limpeza em ratos controles e expostos agudamente ao fipronil, ao fipronil mais diazepam e ao fipronil mais flumazenil (N=15). CT F F + DZ F + FZ 0 10 20 30
*
**
**
*
*
Te m po ( se g .)Os valores representam a Média ± Erro Padrão da Média. CT = Controle F = Fipronil DZ = Diazepam FZ = Flumazenil *p<0,05 do Controle **p<0,05 do Fipronil (Tukey-Kramer).
No gráfico 2, observa-se que administração de fipronil provocou um aumento, estatisticamente significante, no comportamento de limpeza dos animais em relação ao controle. Administração de fipronil mais diazepam provocou uma diminuição estatisticamente significante, no comportamento de limpeza dos animais em relação ao controle e em relação ao fipronil. A administração de fipronil mais flumazenil provocou um aumento estatisticamente significante do comportamento de limpeza em relação ao controle e ao fipronil.
Gráfico 3 - Comportamento de locomoção em ratos controles e expostos agudamente ao fipronil, ao fipronil mais diazepam e ao fipronil mais flumazenil (N=15). CT F F + DZ F + FZ 0 25 50 75
***
N ú m er o de escor esOs valores representam a Média ± Erro Padrão da Média. CT = Controle F = Fipronil DZ = Diazepam FZ = Flumazenil *p<0,05 do Controle **p<0,05 do Fipronil (Tukey-Kramer).
No gráfico 3, observa-se que administração de fipronil não modificou o comportamento de locomoção dos animais em relação ao controle. Administração de fipronil mais diazepam provocou uma diminuição estatisticamente significante, no comportamento de locomoção dos animais em relação ao controle e em relação ao fipronil. A administração de fipronil mais flumazenil não modificou o comportamento de locomoção dos animais em relação ao controle e ao fipronil.
Gráfico 4 - Comportamento de levantar em ratos controles e expostos
agudamente ao fipronil, ao fipronil mais diazepam e ao fipronil mais flumazenil (N=15). CT F F + DZ F + FZ 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0
*
**
*
**
N ú m er o de escor esOs valores representam a Média ± Erro Padrão da Média. CT = Controle F = Fipronil DZ = Diazepam FZ = Flumazenil *p<0,05 do Controle **p<0,05 do Fipronil (Tukey-Kramer).
No gráfico 4, observa-se que administração de fipronil provocou um aumento, estatisticamente significante, no comportamento de levantar dos animais em relação ao controle. Administração de fipronil mais diazepam provocou um aumento (98%), estatisticamente não significante, no comportamento de levantar dos animais em relação ao controle. Administração de fipronil mais diazepan provocou uma diminuição, estatisticamente significante, no comportamento de levantar dos animais em relação ao fipronil. A administração de fipronil mais flumazenil provocou um aumento estatisticamente significante do comportamento de locomoção em relação ao controle e em relação ao fipronil.
A tabela 2 e os gráficos de 5 a 8, contêm os resultados da avaliação comportamental realizada no Labirinto em Cruz Elevado.
Tabela 2 – Resultados da avaliação comportamental realizada no Labirinto em Cruz Elevado em animais controle e recebendo fipronil, fipronil mais diazepam e fipronil mais flumazenil.
Comportamento Grupos Experimentais
Controle Fipronil Fipronil +
Diazepam Flumazenil Fipronil +
Número de entradas nos braços abertos 4,51 ±0,61 ±0,40 3,04 ±0,33 ** 1,27 * 5,25 ** ±0,47 Número de entradas nos braços fechados 7,76 ±0,73 ±0,62 6,52 ±0,50 ** 1,80 * ±0,72 8,27 Tempo de permanência nos braços abertos 40,46 ±8,48 44,20 ±7,90 ±32,19 ** 124,61 * 27,21 ±3,25 Tempo de permanência nos braços fechados 177,63 ±11,64 191,15 ±15,84 110,73 ** ±22,29 241,12 ±23,74
Os valores representam a Média ± Erro Padrão da Média. *p<0,05 do Controle **p<0,05 do Fipronil (Tukey-Kramer).
Gráfico 5 - Comportamento da entrada nos braços abertos em ratos controles e expostos agudamente ao fipronil, ao fipronil mais diazepam e ao fipronil mais flumazenil (N=15). CT F F + DZ F + FZ 0.0 2.5 5.0 7.5
*
**
**
N ú m er o de escor esOs valores representam a Média ± Erro Padrão da Média. CT = Controle F = Fipronil DZ = Diazepam FZ = Flumazenil *p<0,05 do Controle **p<0,05 do Fipronil (Tukey-Kramer).
No gráfico 5, observa-se que administração de fipronil provocou uma diminuição (33%), estatisticamente não significante, no comportamento de entrada nos braços abertos dos animais em relação ao controle. Administração de fipronil mais diazepam provocou uma diminuição estatisticamente significante, no comportamento de entrada nos braços abertos dos animais em relação ao controle e em relação ao fipronil. A administração de fipronil mais flumazenil provocou um aumento no comportamento de entrada nos braços abertos, estatisticamente não significante, em relação ao controle (16%) e um aumento, estatisticamente significante, no comportamento de entrada nos braços abertos em relação ao fipronil.
Gráfico 6 - Comportamento da entrada nos braços fechados em ratos controles e expostos agudamente ao fipronil, ao fipronil mais diazepam e ao fipronil mais flumazenil (N=15). CT F F + DZ F + FZ 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0
*
**
N ú m er o de escor esOs valores representam a Média ± Erro Padrão da Média. CT = Controle F = Fipronil DZ = Diazepam FZ = Flumazenil *p<0,05 do Controle **p<0,05 do Fipronil (Tukey-Kramer).
No gráfico 6, observa-se que administração de fipronil provocou uma diminuição (16%), estatisticamente não significante, no comportamento de entrada nos braços fechados em relação ao controle. Administração de fipronil mais diazepam provocou uma diminuição, estatisticamente significante, no comportamento de entrada nos braços fechados em relação ao controle e em relação ao fipronil. A administração de fipronil mais flumazenil provocou um aumento (27%), estatisticamente não significante, comportamento de entrada nos braços fechados em relação ao fipronil.
Gráfico 7 – Tempo de permanência nos braços abertos em ratos controles e expostos agudamente ao fipronil, ao fipronil mais diazepam e ao fipronil mais flumazenil (N=15). CT F F + DZ F + FZ 0 50 100 150 200
*
**
Te m po ( se g. )Os valores representam a Média ± Erro Padrão da Média. CT = Controle F = Fipronil DZ = Diazepam FZ = Flumazenil *p<0,05 do Controle **p<0,05 do Fipronil (Tukey-Kramer).
No gráfico 7, observa-se que administração de fipronil não modificou o tempo de permanência nos braços abertos em relação ao controle. Administração de fipronil mais diazepam provocou um aumento, estatisticamente significante, no tempo de permanência nos braços abertos em relação ao controle e em relação ao fipronil. A administração de fipronil mais flumazenil provocou uma diminuição, estatisticamente não significante, no tempo de permanência nos braços fechados em relação ao controle (33%) e em relação ao fipronil (38%).
Gráfico 8 – Tempo de permanência nos braços fechados em ratos controles e expostos agudamente ao fipronil, ao fipronil mais diazepam e ao fipronil mais flumazenil (N=15). CT F F + DZ F + FZ 0 100 200 300
**
Tem p o ( s eg. )Os valores representam a Média ± Erro Padrão da Média. CT = Controle F = Fipronil DZ = Diazepam FZ = Flumazenil **p<0,05 do Fipronil (Tukey-Kramer).
No gráfico 8, observa-se que administração de fipronil não modificou o tempo de permanência nos braços fechados em relação ao controle. Administração de fipronil mais diazepam provocou uma diminuição, estatisticamente não significante, no tempo de permanência nos braços fechados em relação ao controle (38%) e uma diminuição estatisticamente significante em relação ao fipronil. A administração de fipronil mais flumazenil provocou um aumento, estatisticamente não significante, no tempo de permanência nos braços fechados em relação ao controle (36%) e em relação ao fipronil (26%).
VI - DISCUSSÃO
Os resultados do presente estudo demonstram que ratos Wistar expostos agudamente ao fipronil têm alterações comportamentais e que estas alterações podem, em parte, ser mediadas pelo GABA.
Alterações do comportamento em animais expostos a um determinado agente químico podem servir como indicativo de que a substância provoca neurotoxicidade. Comportamento tem sido, por isto, utilizado como um bioindicador de função (WORMLEY et al., 2004) para estudar efeitos tóxicos de agentes químicos, como o fipronil, por exemplo.
A importância de estudos neurocomportamentais reside no fato de que comportamento é considerado como um produto final funcional de vários processos sensoriais, motores e integrativos, que ocorrem no sistema nervoso. Por isso, avaliação de alterações comportamentais tem sido agora reconhecida como um indicador padrão de toxicidade em humanos e animais, expostos aguda e cronicamente a baixas concentrações de agentes químicos considerados por terem potencial neurotoxicante (CLÁUDIO et al., 2000; WORMLEY et al., 2004).
Nos experimentos desenvolvidos neste trabalho, utilizando a atividade neurocomportamental para avaliar neurotoxicidade, observaram-se efeitos importantes de interação nos animais expostos ao fipronil e diazepam bem como fipronil e flumazenil.
O teste de campo aberto é considerado como um indicador do estado emocional do animal (ARCHER, 1973) e é comumente utilizado para triagem farmacológica de drogas que atuam sobre o sistema nervoso central (EIDMAN et al., 1990). Neste teste, os comportamentos de locomoção e de levantar são considerados, respectivamente, como medidas das atividades locomotora e exploratória, enquanto que os de limpeza e de congelamento são positivamente correlacionados com medo ou emocionalidade (HENDERSON, 1970; ARCHER, 1973; EIDMAN et al., 1990; BARROS et al., 1994; BHATTACHARYA, 1994).
No presente experimento, as alterações observadas nos animais recebendo fipronil foram: aumento dos comportamentos de congelamento, limpeza e levantar. Se por um lado apenas o comportamento de levantar foi
estatisticamente significante, por outro lado, não se pode desprezar a significância biológica do percentual de aumento dos comportamentos de congelamento e limpeza (55% e 95% respectivamente). Assim, pode-se sugerir que o fipronil aumenta a emocionalidade e a atividade exploratória dos animais sem modificar sua atividade locomotora. Esses resultados contradizem os resultados de Archer (1973) sugerindo que emocionalidade aumentada poderia inibir exploração.
O teste do labirinto em cruz elevado é considerado um indicador do estado de ansiedade do animal (PELLOW e FILE, 1986) e um número maior de entradas nos braços fechados juntamente com um tempo maior de permanência nos mesmos refletem um grau de ansiedade elevado nos animais. Nos experimentos o fipronil diminuiu de forma não significante as entradas nos braços abertos e fechados do labirinto, sem mudar o tempo de permanência em ambos. Isto sugere que o praguicida não influenciou o estado de ansiedade dos animais. Por outro lado, a relação de entradas fechado/aberto, foi maior nos animais recebendo o fipronil (Ct=1,72; F=2,14). Isto parece confirmar a maior atividade exploratória observada na arena de campo aberto nos animais recebendo o fipronil.
O diazepam, um fármaco anticonvulsivante do grupo dos benzodiazepínicos, tem sido utilizado para estudar os efeitos neurotóxicos de substâncias que exercem ação inibitória sobre o complexo canal ionóforo cloro- receptor GABAA ligando-se na interface proteína lipídeo da membrana do
receptor, levando como conseqüência, a efeitos estimulantes do sistema nervoso central e convulsões (GAMMOM et al.,1981; VALENTINE, 1990). Como o diazepam exerce uma ação estimulante sobre a transmissão gabaérgica (MOREIRA et al., 2000) e o fipronil bloqueia o GABA (HAINZL e CASIDA, 1996; OZOE et al., 2000; TANG et al., 2004), nossa suposição era a de que nos animais experimentais o diazepam fosse capaz de antagonizar os efeitos comportamentais do fipronil, se realmente o GABAestivesse envolvido no mecanismo de ação de toxicidade neurocomportamental do praguicida. Seguindo esta linha de raciocínio, a ação antagonista do diazepam, no presente experimento, pôde ser observada nos comportamentos de limpeza, levantar e na permanência nos braços fechados.
Considerando que ansiedade pode ser encarada como um componente do estado emocional (CRAIG et al., 1995), o efeito do diazepam sobre a alteração da ansiedade observada na permanência dos animais no braço fechado do labirinto é consistente com as interações do benzodiazepínico sobre a emocionalidade dos animais recebendo fipronil, detectada no teste da arena de campo aberto, por meio dos comportamentos de limpeza e levantar e reforça a sugestão do envolvimento do GABA nos efeitos neurocomportamentais do fipronil.
Do mesmo modo, o flumazenil, um antagonista do GABA (HALL et al., 2004), também tem sido utilizado para estudar a ação de drogas sobre a transmissão gabaérgica. Utilizando o flumazenil, esperava-se que, ao contrário do que foi observado anteriormente com o diazepam, nos animais experimentais o flumazenil fosse capaz de intensificar os efeitos do fipronil, se realmente o GABAestivesse envolvido no seu mecanismo de ação neurotóxica. A ação intensificadora do flumazenil sobre efeitos do fipronil pôde ser observada nos comportamentos de limpeza, levantar e na permanência nos braços fechados. Isto confirma o que foi observado com o diazepam e também reforça a sugestão do envolvimento do GABA nos efeitos neurocomportamentais do fipronil.
Não existem dados de literatura sobre influência do diazepam ou
flumazenil na ação neurocomportamental de agentes químicos do grupo dos fenilpirazóis, do qual o fipronil é integrante. Este fato dificulta a comparação dos presentes resultados com os de outros autores, porém, valoriza e atribui a este estudo um caráter inédito.
Observando as ações do diazepam e do flumazenil sobre os comportamentos de congelamento, na arena de campo aberto, e entradas nos braços abertos e fechados, no labirinto em cruz elevado, pôde-se notar que ocorreu o inverso do que se esperaria, quando diazepam e/ou flumazenil foram administrados conjuntamente com o fipronil, ou seja, o diazepam parece ter potenciado enquanto o flumazenil parece ter antagonizado o fipronil. Isto poderia sugerir talvez uma mediação diferente daquela exercida pelo GABA nas alterações observadas. Será que, à semelhança de outros pesticidas como, por exemplo, os inseticidas organoclorados, o fipronil poderia estar
modificando a extrusão do cálcio celular neuronal interferindo com a enzima de membrana celular, ATPase Ca+Mg+-dependente?