Com o crescente número de casos da LVC nos grandes centros metropolitanos do país, torna-se necessário a realização de estudos mais detalhados da doença no cão, uma vez que ele é o principal mantenedor da leishmaniose no ambiente doméstico e peridoméstico, seja na região rural ou urbana. A permanência e replicação do parasito na pele de hospedeiros infectados faz deste órgão um reservatório de amastigotas de Leishmania infantum para fêmeas de flebotomíneos. Portanto, um estudo histopatológico desse órgão, associado à quantificação do parasitismo cutâneo bem como às diferentes formas clínicas da doença é bastante relevante, permitindo assim uma melhor compreensão da história natural da LVC bem como dos processos relacionados à patogenia das lesões cutâneas.
3.1 - Objetivo geral
Avaliar as alterações histopatológicas na pele de orelha de cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) infantum considerando as diferentes formas clínicas bem como a carga parasitária.
3.2 - Objetivos específicos
Avaliar na pele de cães naturalmente infectado por Leishmania (Leishmania)
infantum:
a carga parasitária;
o processo inflamatório;
4.1 - Animais
Os animais utilizados nesse trabalho foram obtidos durante o doutoramento de Wendel Coura-Vital (Coura-Vital, 2011). O uso dos mesmos foi aprovado pelos comitês de ética das seguintes instituições: Universidade Federal de Ouro Preto/UFOP (Nº. 2007/83); Universidade Federal de Minas Gerais (Nº. 020/2007) e Prefeitura Municipal de Belo Horizonte (Nº. 001/2008). Inicialmente foram utilizados 62 cães sem raça definida, provenientes do Centro de Controle de Zoonoses da Prefeitura Municipal de Belo Horizonte (CCZ-PBH). Estes animais foram recolhidos para serem eutanasiados, conforme preconizado pelo Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral (PVC-LV), por apresentarem resultado sorológico positivo - ELISA e RIFI (Biomanguinhos, Fiocruz, RJ) para Leishmania sp. Esses testes foram realizados pelo Laboratório de Zoonoses da Prefeitura Municipal de Belo Horizonte (LZOON).
4.2 - Caracterização clínica dos animais
Com o auxílio de um médico veterinário, dos 62 cães inicialmente incluídos no trabalho, 35 deles foram divididos em três grupos, de acordo com a presença ou ausência de sinais clínicos sugestivos da infecção por L. infantum, tais como: onicogrifose, atrofia muscular, lesões de pele, dermatite furfurácea, alopecia, ceratoconjuntivite, paralisia dos membros posteriores, emagrecimento, dentre outras, seguindo os critérios estabelecidos por Mancianti et al. (1998) e Reis et al. (2006) que ao final possibilita subdividir os cães em: assintomáticos (CA), oligossintomáticos (CO) e sintomáticos (CS), como representado na Figura 1. Sendo assim, 11 cães foram classificados como assintomáticos, 12 cães como oligossintomáticos e 12 cães como sintomáticos. Ainda, foram utilizados dez animais controle negativo nesse estudo.
Figura 1: Classificação clínica de cães naturalmente infectados por Leishmania
infantum. (A) assintomático, (B) oligossintomático e (C) sintomático.
4.3 - Obtenção do material biológico e delineamento experimental
Para eutanásia dos cães, conforme determinado pelo PVC-LV (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006), os animais foram anestesiados com Tiopentax® (30mg/Kg, Cristália). Em seguida, com o animal ainda anestesiado, foi aplicada solução saturada de KCl por via endovenosa. Após a eutanásia dos animais, as amostras de pele de orelha dos cães foram obtidas de forma asséptica e subdivididas em fragmentos menores. Parte deste material biológico foi armazenado em formol tamponado e destinado à avaliação histopatológica. Outros fragmentos foram armazenados em freezer a temperatura de - 80ºC até o momento da extração de DNA total, para posterior avaliação da carga parasitária por PCR em tempo real.
Figura 2: Delineamento experimental do estudo
Sintomático (CS) (n=12) Controle negativo (CN) (n=10) Assintomático (CA) (n=11) Oligossintomático (CO) (n=12) Processo inflamatório
Cães naturalmente infectados por L. infantum
(n=35) Pele da orelha Parasitismo tecidual Mastócitos Matriz extracelular
4.4 - Avaliação da carga parasitária na pele de orelha por Real time PCR
4.4.1 - Extração de DNA das amostras de Pele
A extração do DNA foi realizada a partir de fragmentos de pele de orelha, previamente armazenados em frezeer -80ºC no dia da necropsia. Para obtenção do DNA das amostras um kit de extração WizardTM Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA) foi utilizado seguindo recomendações do fabricante com modificações, conforme brevemente descrito. Foram utilizadas quantidades de tecidos com peso de 30mg. Aos tubos contendo os fragmentos de pele foram adicionadas proteinase K (30mg/mL) e a solução de lise nuclear. Em seguida as amostras foram incubadas overnight (18 horas) em banho seco a 55°C. No dia seguinte foi adicionado 3µL da solução de RNase ao lisado nuclear, seguida de homogeneização e incubação em banho seco a 37ºC por 30 minutos. As amostras foram resfriadas por cinco minutos a 25ºC e em seguida foi adicionado 200μL da solução de precipitação protéica. Com auxílio de um homogeneizador tipo vórtex, as amostras foram homogeneizadas por 20 segundos em baixa velocidade e incubadas no gelo por cinco minutos. Em seguida foram centrifugadas a 16000 x g em microcentrífuga (Eppendorf- Modelo 5418, NY, USA) durante cinco minutos. O sobrenadante foi transferido para novo tubo, onde se adicionou 600µL de isopropanol (Merck, Darmstad, Alemanha) e as amostras foram homogeneizadas por inversão dos tubos. Após este procedimento, foi realizada centrifugação a 16000 x g durante dois minutos e o sobrenadante descartado. Posteriormente foi acrescentado 600µL de etanol 70% (Merck, Darmstad, Alemanha), a amostra homogeneizada e centrifugada a 16000 g por dois minutos, sendo o sobrenadante desprezado. As amostras foram deixadas por 1 hora a 21-25ºC para total evaporação do etanol. Posteriormente, foi adicionado 100µL de solução de hidratação e as amostras foram mantidas em banho seco a 37º C por uma hora. Após este tempo as amostras foram mantidas a 21-25ºC por duas horas e em seguida foram armazenadas em geladeira a 4°C até o momento da análise da qualidade do DNA extraído e o início da reação de PCR.
4.4.2 - Reação em cadeia da Polimerase – PCR
Para a reação, foi utilizado DNA de L. infantum (5,0ng/μL). A reação constituiu de: tampão 1X, 1,5mM de MgCl2, 2,0µM de dNTP, primer (5pmol), 0,76µL U Taq
DNA polimerase (Fermentas -Sinapse®), 2,5µL de DNA e H2O Milli Q totalizando um
volume de 12,5µL por poço da placa (MicroAmp® Fast Optical 96-Well, Applied Biosystems). As condições utilizadas na reação de PCR foram: desnaturação inicial a 94°C por um minuto, seguida por 40 ciclos a 93ºC por 30 segundos, 64°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto e uma extensão final a 72°C por sete minutos. O equipamento utilizado para a realização de PCR foi o Verit Termal Cycler 96 well (Applied Biosystems®, Califórnia, USA). Parte do produto final da reação foi aplicada em um gel de agarose 1,5% (Invitrogen by Life Technologies, EUA), para comprovar o resultado da amplificação pela visualização da banda de interesse (90 pb).
4.4.3 - Clonagem
Para a construção da curva padrão utilizada na qPCR, foi realizada clonagem do gene da DNA polimerase de Leishmania. Para isto, o gene de interesse foi amplificado por PCR convencional a partir de DNA genômico extraído pelo kit WIZARD® DNA isolation kit (PROMEGA, EUA), conforme descrito anteriormente. Para a reação de PCR, foi utilizado DNA de L. infantum (5,0 ng/μL). A reação constituiu das mesmas condições utilizadas para as amostras de pele. Parte do produto final da reação foi aplicada em um gel de agarose 1,5% (Invitrogen by Life Technologies, EUA), para comprovar o resultado da amplificação pela visualização da banda de interesse (90 pb). Após confirmação da presença e integridade da banda de interesse, e a ausência de outros amplicons, o produto da PCR foi clonado utilizando o sistema de clonagem pGEM T (Promega, EUA) conforme manual do fabricante. Para cada reação de ligação, foi preparado um mix contendo 5 μL de “2X Rapid Ligation Buffer”, 1 μL de “p-GEM-T Easy Vector” e 1 μL de “T4 DNA Ligase” e a razão molar foi 8:1 de inserto e vetor. Após ser homogeneizado, o tubo foi mantido overnight a 4ºC para ocorrer à reação de ligação do inserto no vetor. Os plasmídios contendo insertos foram então utilizados para transformar bactérias DH5 competentes.
4.4.4 - Preparo de bactérias competentes e transformação bacteriana
A- Preparo de bactérias competentes
As bactérias DH-5foram inoculadas em 5mL de meio Luria Bertani (LB)1X (Bacto triptona 1%p/v; extrato de levedura 0,5%p/v; NaCl 171mM) e incubadas sob agitação 180rpm (Shaker, Innova 44), a 37ºC por 16 horas. A cultura bacteriana foi transferida para 500mL de meio LB e novamente incubada a 37ºC a 180rpm. O crescimento foi acompanhado até a cultura atingir uma A600 nm igual a 0,6,
correspondendo ao crescimento equivalente à metade da fase logarítmica. As bactérias foram centrifugadas a 5000rpm durante 10 minutos a 4ºC e o sedimento homogeneizado em 150mL de 75mM de CaCl2,10mM de Tris-HCl pH 8,0. Subsequentemente, a
suspensão bacteriana foi incubada em gelo por 20 minutos e centrifugada, como descrito previamente. O sedimento celular foi ressuspenso em 30mL da mesma solução, acrescida de 15% de glicerol e congelado rapidamente em mistura, gelo seco álcool e mantidas a -80ºC, até o momento do uso.
B-Transformação
A transformação bacteriana foi realizada utilizando 5μL da reação de ligação, adicionadas a 50μL de bactéria Escherichia coli DH5-y quimiocompetentes, descongeladas em gelo. Esta mistura foi homogeneizada levemente e mantida em gelo por 30 minutos, subsequentemente foi transferida para um banho aquecido a 42ºC por 2 minutos, e em seguida, colocada em banho de gelo por 2 minutos, sendo imediatamente adicionado a ela 1μL de meio LB 1X sem antibióticos a cada tubo, os quais foram incubados por 1 hora no Shaker a 200-300rpm a 37ºC. A cultura bacteriana foi sedimentada em microcentifuga, a 1000rpm por 5 minutos. Em seguida, foi homogeneizada em 100L de meio LB e um volume de 50L foi semeada em placas de Petri contendo LB-ágar (LB acrescido de 1% de ágar) acrescido de ampicilina (100mg/mL), 0,4μL de Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e 4μL de 5- bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) 4%. Após este procedimento foi incubada em estufa B.O.D. (Estufa D.B.O., EletroLab, Brasil) a 37ºC overnight (16 horas).
No dia seguinte, as colônias brancas, consideradas positivas, foram submetidas à triagem por PCR conforme especificado no item 4.4.2, para a confirmação do inserto. As colônias positivas para o inserto foram selecionadas para purificação do DNA plasmidial.
4.4.5 - Purificação de DNA plasmidial
Para obtenção de DNA plasmidial em pequena escala foi utilizado o kit Wizard Miniprep (Promega,USA). O crescimento bacteriano foi feito em 10mL de meio LB com ampicilina a 37ºC por 16 horas. Posteriormente, a cultura bacteriana foi centrifugada por 5 minutos a 5000rpm, a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspendido em 250µL de solução de ressuspensão. Em seguida, foram adicionados 250µL de solução de lise e a mistura foi homogeneizada por inversão 4 vezes. Subsequentemente foram adicionados 10µL de solução de protease alcalina, a mistura foi invertida quatro vezes e incubada por cinco minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, foram adicionados 350µL de solução de neutralização e a mistura foi homogeneizada por inversão, centrifugada a 13000rpm por 10 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, o sobrenadante foi removido e transferido para uma coluna contida em tubo coletor. Posteriormente, a coluna foi acoplada a um tubo de microcentrífuga e centrifugada a 13000rpm por 1 minuto, a temperatura ambiente. Foram adicionados 750µL de solução de lavagem a coluna, centrifugada a 13000rpm por 1 minuto. Este procedimento de lavagem foi repetido por mais uma vez. O DNA plasmidial foi eluído em 50L de água livre de nucleases e mantido a - 20ºC, para posterior análise por qPCR em tempo real.
4.4.6 - Construção de curvas-padrão para a qPCR em tempo real
O produto da clonagem do gene de L. infantum, foi utilizado para a construção da curva-padrão. Os vetores contendo os insertos foram inicialmente dosados utilizando o equipamento Nanovue (GE Healthcare Bio Sciences AB Sweden) a 260nm e 280nm. A partir da dosagem obtida, calculou-se a concentração de DNA em μg/μL, de acordo com a fórmula:
pmol/μL = μg/μL x 106pg x 1pmol x 1
1 μg 660pg N
Onde;
N é o número de nucleotídeos (plasmídeo e inserto); 660pg é a massa molecular média de um ácido nucléico.
Levando-se em consideração o número de Avogadro: 1mol = 6,02x1023 moléculas, e sabendo-se que a concentração de cada solução de plasmídeo+inserto de interesse em pmol/μL, foi possível determinar o número de moléculas presentes por microlitro de cada amostra.
Depois de realizados estes cálculos, as amostras foram diluídas sucessivamente, sendo que aquelas contendo de 107 até 100 moléculas foram utilizadas para a construção da curva-padrão. As reações de qPCR foram realizadas em placas de 96 poços - MicroAmp®Optical 96 - Well Reaction Plate with Barcode (Applied Biosystems by Life Technologies, EUA), cobertas com adesivos ópticos- Optical Adhesive Covers (Applied Biosystems, EUA) e processadas em termociclador ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, EUA) no Laboratório de Pesquisas Clínicas (LPC/CIPHARMA/UFOP). Além da curva padrão, o gene de referência G3PDH foi utilizado com o objetivo de verificar a integridade das amostras de DNA extraídas dos tecidos de cães (pele). As amostras dos diferentes tecidos em estudo foram analisadas utilizando como gene alvo a DNA polimerase alfa. As informações referentes aos primers utilizados neste trabalho estão listadas na Tabela 1.
Tabela 1: Informações sobres os primers utilizados na qPCR.
Gene Sequência do
nucleotídeo (5´-3´) Organismo Função Tamanho do amplicon (pb) Número de acesso ao GeneBank Eficiência da Reação (%) R2 G3PDHa
Cão Envolvido na glicólise
e gliconeogênese
90 AB038240 99,9% 0,99
F TCA ACG GAT TTG GCC
GTA TTG G
R TGA AGG GGT CAT TGA
TGG CG DNA Pol
αb
F TGT CGC TTG CAG
ACC AGA TG Leishmania
Envolvido na síntese do DNA do parasito 90 AF009147 95% 0,97 R GCA TCG CAG GTG TGA GCA C
a O gene G3PDH foi previamente amplificado por Peters et al., 2007.
b O gene de cópia única que codifica a DNA polimerase α foi previamente amplificado por Bretagne et al., 2001. c Coeficiente de correlação.
Como controles positivos foram utilizadas as amostras diluídas do plasmídeo contendo o inserto utilizado na curva padrão; e como controle negativo foi usado água livre de nucleases. A reação de cada amostra foi realizada em duplicata nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC por 10 min, seguida por 40 ciclos de 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto. As reações foram realizadas utilizando-se SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, EUA); DNA (5 ng/μL); iniciadores (5 pmol/μL) e água livre de nucleases em quantidade suficiente para um volume final de 10 μL por poço. As análises foram realizadas usando o software ABI SDS no equipamento ABI7500 (Applied Biosystems), que permite avaliar: (i) a curva de dissociação; (ii) a intensidade de fluorescência da amostra; (iii) o número de ciclos em que a fluorescência cruza uma linha limiar arbitrária threshold (Ct) em cada ciclo e (iv) a quantificação do número de parasitos de acordo com a curva padrão (quantificação absoluta) (Figuras 3 e 4).
A
B
C
R eport er norm al iz ado Temperatura ( C)Figura 3: Curvas de dissociação de amostras de pele de cães naturalmente infectados. (A) Animal negativo (Tm= 76,34). (B) Animais com baixa carga (1 parasito). (C) Animais com alta carga (4747 parasitos). No eixo x está representada a temperatura de dissociação do amplicon gerado pela reação de PCR e no eixo Y a derivada do valor de emissão de fluorescência.
Para a análise dos resultados foram consideradas as reações com eficiência entre 96-110% e curva padrão com valores satisfatórios de coeficiente de linearidade (r2 =
Figura 4: Exemplo da curva padrão referente ao gene da DNA polimerase de L.
infantum no sistema SYBR®-Green. Em X estão demonstrados os valores de Log da concentração de parasitos (107 a 100) e em Y os valores de Ct correspondes a cada diluição. Abaixo do gráfico está representado o valor do slope (-3,328), coeficiente de linearidade (R2 =0,997) e a eficiência (99,74%).
4.5 - Avaliação histológica
Fragmentos de pele de orelha fixadas em formol 10% tamponado pH 7,2, foram processados rotineiramente e embebidos em parafina para posterior corte em micrótomo. Sobre lâminas de vidro, previamente desengorduradas com álcool, foram colocados cortes histológicos com espessura de aproximadamente cinco μm. Foram confeccionadas quatro lâminas, sendo uma corada com Hematoxilina-Eosina (H&E) para a avaliação do processo inflamatório, uma corada com Azul de toluidina para avaliação do número de mastócitos e as demais para avaliação da matriz extracelular coradas pelo Tricrômico de Masson e Picrosirius-Red. Estes procedimentos operacionais são padrões do laboratório de Imunopatologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (LIMP/NUPEB/UFOP), seguindo as normas de controle de qualidade do laboratório.
4.5.1 - Análise morfométrica
As imagens de pele de orelha foram digitalizadas através da microcâmera Leica DFC340FX associada ao microscópio Leica DM5000B e todas as imagens foram analisadas pelo software de análise e processamento de imagem Leica Qwin no Laboratório Multiusuários do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas/NUPEB da UFOP.
4.6 - Avaliação do processo inflamatório por microscopia ótica
4.6.1 - Hematoxilina-Eosina (H&E)
A H&E foi utilizada para análise rotineira das alterações histopatológicas, incluindo a quantificação do processo inflamatório. Os cortes de pele de orelha desparafinados e hidratados foram corados pela Hematoxilina e após serem lavados em água corrente para retirada do excesso do corante, foram contra-corados pela Eosina. Após a última lavagem em água corrente, foram desidratados e montados com lamínula e Entellan (Merck, Darmstadt, Germany).
O processo inflamatório na pele foi quantificado em 20 imagens aleatórias (área total percorrida igual a 1,5 x 106 µm2). As imagens visualizadas pela objetiva de 40x foram digitalizadas e o processo inflamatório determinado pelo número de núcleos de células inflamatórias presentes nos animais infectados.
4.7 - Avaliação do número de mastócitos por microscopia ótica
4.7.1 - Azul de toluidina
Após desparafinização e hidratação, as lâminas foram imersas no corante Azul de toluidina por dez minutos. Após lavagem rápida em água destilada as lâminas foram colocadas na estufa para secagem. Posteriormente foram montadas com lamínula e Entellan (Merck, Darmstadt, Germany). Após coloração, foi realizada quantificação do número de mastócitos, com auxílio da objetiva de 100x, obtendo o número dessas células após avaliação em 20 campos aleatórios.
4.8 - Avaliação da matriz extracelular por microscopia ótica
4.8.1- Tricrômico de Masson
As lâminas desparafinadas e hidratadas foram imersas no corante Sudam
III/Fucsina, seguido por diferenciação em solução de ácido
Fosfotúngstico/Fosfomolíbdico e contra-coradas pela solução de Azul de Anilina. Posteriormente, desidratadas em álcool e montadas utilizando-se Entellan (Merck, Darmstadt, Germany) para fixação das lamínulas às lâminas. Entre cada uma dessas etapas as lâminas foram lavadas em água corrente.
Em lâminas coradas por Tricrômico de Masson, que distingue as fibras colágenas em cor azul e as células inflamatórias em tons avermelhados, foram obtidas 30 imagens aleatórias com auxílio da objetiva de 40x, as quais foram digitalizadas e analisadas semi-automaticamente pela função de segmentação de imagens. Logo, todos os pixels com tons azuis foram selecionados para a criação de uma imagem binária e posterior cálculo da área total ocupada por fibras colágenas.
4.8.2 - Picrossirius-Red
As lâminas desparafinadas e hidratadas foram imersas na solução de Picrossírius Red por 1 hora, lavadas em água e contra-coradas com Hematoxilina por 3 minutos. A seguir foram desidratadas em álcool e montadas utilizando-se Entellan (Merck, Darmstadt, Germany) para fixação das lamínulas às lâminas.
Esse tipo de coloração foi utilizado para caracterização do tipo de colágeno presente na matriz, o qual foi analisado em microscópio de luz polarizada, que segrega o colágeno fino (tipo III - marcado em amarelo e vermelho) do denso (tipo I - marcado em verde). As imagens obtidas com auxílio da objetiva de 10x de toda a extensão do corte foram quantificadas com a seleção dos pixels em amarelo e vermelho ou em verde, que correspondem à área de colágeno tipo I e III, respectivamente.
4.9 - Análises estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas usando o GraphPad Prism 5.0 (Prism Software, Irvine, CA, USA). Depois de demonstrada a normalidade dos dados usando o teste Kolmogorov-Smirnoff, foi realizada análise de variância (ANOVA one-way) seguida do teste de Tukey para determinar as diferenças específicas entre os grupos. Em todas as análises estatísticas as diferenças foram consideradas significativas quando o valor de P foi menor que 0,05. Todos os resultados obtidos nesse trabalho foram paramétricos, exceto o resultado de carga parasitária. Para análise desse resultado foi também utilizado o programa Biostat (AnalystSoft Robust Business solutions).