Kỹ thuật sản xuất thuốc trừ sâu từ Bacillus thuringlensis

Đặc điểm vi khuẩn Bacillus thurỉngiensis (BT): Vi khuẩn BT là vi khuẩn hình que và có những đặc điểm:

- K í c h t h ư ớ c 3 - 6 X 0 , 8 - 1 ,3 |w n.

- Thuộc vi khuẩn gram (+).

- Tế bào thường đứng riêng rẽ hay xếp th àn h chuồi.

- Có tiên mao mọc xung quanh tế bào (tiên nao dài khoảng 6-8 um). - Khi trưởng th àn h tạo một bào tử ỏ giữa

(kích thước bào tử: 1 - 1,8 X 0,8 - 0,9 |im.

- Chứa một tinh th ể độc hình quả trám có bản chất protein.

Độc tố của BT: BT có khả năng tạo ra 4 loại độc tố trong quá trình phát triển của chúng:

- Ngoại độc tô' a (a - exotoxin) hay còn gọi ià photpholipase-C. - Ngoại độc tố p (p - exotoxin) hay còn gọi là ngoại độc tố bền nhiệt. - Nội độc tố ô (Ồ - endotoxin) hay còn gọi là tinh th ể độc.

- Độc tố tan trong nước.

T ron g bốn lo ạ i độc tô' của BT, người ta quan tâ m n h ấ t đ ến độc t ố tan tro n g nước và tin h th ể độc.

a) Độc tố ta n trong nước được P.G. Fast tìm ra năm 1971. Độc tố này có phân tử lượng là 30 000, gây ra nhiều bệnh lý ở côn trùng.

b) Ngoại độc tố p là độc tố bền nhiệt (ở 120°c sau 15 phút vẫn giữ được hoạt tính). Độc tố này có trọng lượng phân tử 707-850. Ngoại độc tố Ậ

có chứà ad errin , p h o tp h a t, rib ose, glu cose, v à a x it allom uxic.

c) Ngoại độc tô a, còn gọi là photpholipase c hay loxitinase c. Enz^ptt

n à y đầu tiê n liê n k ế t với t ế bào, sau đó được tá c h ra v à b ị h o ạ t h ổ a bởi ch ấ t k h ô n g b ền n h iệ t, có tr ọ n g ỉượng p h â n tử th ấ p .

d) Tinh th ể độc: n h à khoa học E. Berliner tìm ra lần đầu tiên vào năm

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT Vi SINH VẬT ₁₄₃

thể được tạo ra trong cơ th ể BT khi BT bắt đầu tạo bào tử.

Mãi đến năm 1955, người ta mđi biết được tin h th ể này là chât có bản chất protein và có liên quan đến dộc tính của BT.

Tinh th ể độc có kích thước khá dài và rộng (dài khoảng 1 ^im và rộng khoảng 0,5 ịim). Chúng chiếm khoảng 30% toàn bộ khôi lượng t ế bào và biểu hiện tín h độc của BT.

Tinh th ể độc thường làm chết các ấu trùng bộ cánh vảy. Trong th àn h phần tinh th ể độc có hai loại axit amin, có sô' lượng nhiều n h ất là axit glutamic và ãxit asparaginic.

Người ta xem tinh th ể độc như một tiền độc tô' (protoxin). Nó chỉ trở thành độc tổ’ thực sự khi có m ặt trong ruột của một sô" côn trùng. Khi đó sẽ hình th àn h những phần tử độc tô' với trọng lượng phân tử vào khoảng 5000. Tinh th ể độc thuộc loại bền nhiệt, thường gây ra sự hủy hoại đường tiêu hóa của sâu bệnh. Khi đường ruột bị tê liệt bởi tinh thể độc, tế bào thượng bì của ruột bị biến đổi. Tinh th ể độc cú a BT chỉ gây độc với đường ruột sâu bệnh còn với người và động vật, tinh th ể độc hoàn toàn vô hại. Nhiều nghiên cứu cho thấy ở động vật có vú, pepsin trong đường tiêu hóa đã làm biến đổi trạng thái độc của tin h th ể độc sang trạn g thái không độc. Khi tinh th ể độc vào được đường ruột côn trùng, có hai yếu tồ' tạo ra tính độc đốì với côn trùng:

- pH của đường ruột côn trùng: pH ở ruột giữa và ở ruột trước của côn trùng nằm trong vùng pH kiềm (> 8,9). Khi pH ở giá trị này, tinh th ể bị vờ ra và gây nhiễm độc cho máu của côn trùng.

- Một số côn trùng tạo ra protease trong đường ruột. Các enzym này sẽ chuyển tiền độc tô của tin h thể th àn h độc tố.

N h ữ n g lo à i sâ u b ị BT g iế t h ạ i

BT không th ể giết nhiều loài sâu bệnh. Tuy nhiên chúng có khả năng giết rấ t lớn một sô' loài côn trùng. Trên 200 loài côn trùng chúng có khả nămg tiêu diệt, trong đó có nhiều loài tiêu biểu như sau:

- Sâu đo acrobat (Acrobasis Spp.) - Bướm hại gai (Aỉbaiis urtiene) - Sâu xám hại rau (Agrotis ypsỉlon) - Bướm phấn Địa Trung Hải (Anagasta) - Ong kén nhỏ (Apanteles glomeratris) - Sâu đo rau vàng (Apochemia brisoidaria) - Bướm trắ n g gân đen (Aporia crataegi)

- Ngài cuốn lá (Archips argurospỉỉiis) - Bướm tai châu (Arctiaenfa)

- Sâu bướm đốm (Argtrcstỉìia conjugclla)

- Sâu cuốn lá cây ăn quả (Argyroplose variegana) - Sâu cắn ỉ á điền thanh (Barathra brassìcae) - Ngài cuồn lá (Cocoecia pocỉana)

- Sảu bông (chloridca dỉspsaea)

- Sâu cuốn lá nhỏ ịCnapìialocrocis medinaỉis} - Bướm vàng (Colias philodice eurythcme) - Sáu róm thông (Dendroỉimus depresseỉỉa) - Sâu róm (Euproctis chrysorrhoea)

- Sâu ống sáp (Galleria mellonella) - Sâu hại lá lớn (Gastropacha quereifolia)

- Sâu non đục củ khoai tây (Gnorimoscchcsma opercuỉella) - Sâu xanh hại bông (Hcliothis armigera)

- Sâu xanh hại ớt (Heliothỉs asuỉla)

- Sâu xanh hại cà chua (Hcliothis absolcla) - Sảu hại ngô (Hcỉiothis zeac)

- Sâu đo đậu (Hemerophila atrineatia)

- Bướm hại táo tây (Hyponomeuta maỉineỉỉus) - Sâu đục quả đậu (Laspeyresia migricana) - Bọ lá khoai tây (Leptỉnotarsa dcccmlineata) - Sâu cắn lá ngô (Lcucania separata)

- Sâu róm hại dâu (Lymantria monaeha) - Sâu đục qua đỗ (Maruca telulatis) - Sâu đục th ân ngô (Ostrinia nubiỉaỉis) - Sâu cuốn lá lúa lớn (Parnara guttata) - Bướm cải (Pieris rapae)

- Bướm phấn trắ n g (Pieris rapae) - Sâu tơ (Plutella niacuỉỉpennis) - Mọt lúa mì (Sỉtophiỉus granarius) - Sâu cưôn lá (Timetocera acellassa) - Bướm vằn (Vanessa urticcae)

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT Vi SINH VẬT ₁₄₅

- Sâu hồng (Zcuzcra ky ri na).

Kỹ thuật sản xuât BT

a) Phương pháp nuôi trên máy lắc

Môi trường nuôi cấy: Ta có thế sử dụng một trong những loại môi trường nuôi cây sau đây đê sản xuàt BT qui mỏ nhỏ.

Môi trường ĩ:

Glucose 1,5g Cao ngô 4,5g Cao 11 âm men 6,0g

K.HPO, 3,5g NaOH 0,43g CaCl, o .lg Nước 1000ml M ô i trường 2: Rỉ đường 10g Cao ngó 8,5g CaCOrt l.Og Nước 1000ml Môi trường 3: Ri dường 18,6g Bột khỏ dầu bòng 17gg

CaCO; l.Og Nước lOOOmỉ

M ô i trường 4:

Tinh bột nhô 68 g Saccharose 64g

Cazein 19,4g Nâm men khô 6g

Dung dịch đệm photphat 60ml Nước 1000ml

M ò ì trường 5:

Pepton log Glucose 5g Tinh bột ngỏ 5g

Cao nấm men 2g K.HPO, 1 g

KH 2PO, 3,5g Nước 1000ml

M ô i trường 6:

Pepton lOg Glucose 10 g

Cao ngô 2g M gS04 0,3g F eS 0 4.7U20 0,02 g ZnS04.7H20 0,02g C aC 03 lg Nước 1000ml M ô i trường 7: Đột đậu tương 15g Glucose 5g Tinh bột ngô 5g MgSƠ4 0,3g F eS 04.7H20 0,02g ZnS04.7H20 0,02g C aC03 lg Nước 1000ml

Môi trường 8:

Pepton 6g Dịch thiíy phân cazein 4g

Cao ngô 4g Cao th ịt l,5g Glucose _lg Niíớc 1000ml Môi trường 9: Saccharose _2g Pepton 7,5g KH2P 04 6,8g M gS04.7H20 0,00223g Fe2(S04)3 0,02g C aC ì,.4H ,0 0,183g Nước 1000ml Môi trường 10:

Bột đậu tương 10g Pepton 2g Dextrin 4g

CaCO;i _lg (NH/j)2S04 0,3g M gS04 0,3g K2H P 04 2g Dầu đậu tương 4 ml Nước 1000ml Môi trường ĩ ĩ: Khô lạc 5g Bột cá 5g Cao ngô 5 g Glucose 3g Dầu đậu tương 2,5g Nước 1000ml Môi trường 12: Khô lạc 20g Bột cá 5g Cao ngô lBg CaCO:ì 5g M gS04 0,075g Dextrin 5g k2h p o4 0,4g Dầu đậu tương 3 ml Nước 1000ml

Điều kiện nuôi cấy chìm

• Máy lắc có tần sô lắc 100 - 200 lượt/phút. Khi lắc không khí qua nút )ông và vào môi trường. Nhu cầu oxy trong nuôi cấy BT rấ t cíiO (khoảng 1 - >% hay 50 - 250 mol/m2)

• Thời gian nuôi < 2 ngày (thường 18 - 20 giờ) • N hiệt độ nuôi 30°c ± 2; pH= 6,5 - 7,2

Sau khi nuôi BT trong các môi trường có th àn h phần dinh dưỡng tối ưu, người ta thu nhận BT bằng cách lọc ép. Sau khi thu sinh khối, người ta tiến h àn h sấy chân không và thu được th àn h phẩm. C hất lượng sinh khối phải đ ạt như sau:

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT ₁₄₇

- Sau khi sấy chân không (thường sấy ở 60°c trong 14 giờ) sô' lượng bào tử sông phải đạt 12,1- 17,8 tỷ/gam chế phẩm

b) Nuôỉ cây trên môi trường đặc

Ta cũng có thể nuôi cấy BT trê n môi trường đặc Môi trường nuôi cấy:

Môi trường được thanh trùng, làm nguội và được gieo cấy giống vào. Quá trình lên men: Toàn bộ môi trường sau khi trộn giống được tải ra khay với chiều dày môi trường 3 - 5cm. Nuôi trong phòng vô trùng, ở nhiệt độ 28 - 32°c trong thời gian 24 - 36 giờ.

Kết thúc quá trìn h lên men, đem chế phẩm BT thô sấy khô; sau đó nghiền mịn và vô bao gói,

C hất lượng chế phẩm được qui định là 5 - 10 tỷ tế bào trong 1 gam Ngoài ra, ta cũng có th ể nuôi trong môi trường bán rắn với thành phần môi trường như sau:

Sau khi khử trùng và làm ngủội ta, trộn môi trường trên với dịch nhân giống đã chứa BT; cứ 1 kg môi trường trộn với 400ml dịch giống (hỗn hợp này có pH = 6,9) rồi đưa vào th iế t bị lên men. Thổi không khí có độ ẩm 95 - 100%, nuôi ở nhiệt độ 30 - 34°c trong thới gian 36 giờ. Sau khi kết thúc quá trìn h lên men tiến hành sấy để sản phẩm cuối có độ ẩm 4% w.

c) Nuôi BT theo qui mô công nghiệp

Trong công nghiệp, BT thường được nuôi trong những thiết bị lên men có dung tích rấ t lớn và được kiểm soát chặt chẽ chế độ thổi khí, pH và lượng các

chất dinh dưỡng. Thông thường, người ta dùng các thiết bị có dung tích 5000 -

10.000 lít với hệ thông thanh trùng, làm nguội, điều hòa oxy, pH hoàn toàn tự động. Nhiệt độ lên men luôạ duy trì ở 28- 32°c, pH = 6,5 - 7,2, chế độ thổi khí đảm bảo 5% dung tích môi trường (hay 250mol oxy/m3 môi trường). Thời gian lên men 24 - 30 giờ. Kết thúc quá trình lên men người ta tách sinh khối và sấy thăng hoa để thu nhận sản phẩm. Bột ngô dầu đậu tương Trấu M gS04 NaOH 15 - 20% Cám 9 - 14% CaCOg 0,1% K2HPO4 1 % 70% 0,15% Cám 545g P erlít xốp 380g Bột đậu tương Glucose 3 6g Vôi 3,6g NaCl

CaCl2 0,29g Nước 160ml

62g 0,9g

2- Kỹ thuật sản xuất thuốc trừ sáu từ nấm bạch cương

Nấm bạch cương (Beauveria): là loại nâin gây ra bệnh bạch cương ở tằm. Loài nâm này phát triền rất nhanh trê n cơ thế tằm . Các sợi nấm nhanh chóng phu đầy tạo ra một màu trắng ở tằm.

Nấm bạch cương có khả năng tạo bào tử trần , không màu hình cầu hoặc hình trứng. Bào tử khi chín bay theo không khí, khi rơi vào con tàm, chúng sẽ phát triền m ạnh th àn h sợi màu trắng. Bào tử có kích thước

1,5 - 5,5x 1,3 ^im. Sợi nấm có chiều ngang 3 - 5fim.

Khi phát triển trên tằm , chúng phá hủy lớp kitin của tằm , ăn sáu vào trong cơ th ể và phát triển trong cơ thề tằm.

Khi nấm bạch cương mới phát triển trên cơ thề tàm, cơ thề tằm huy dộng hệ bạch huyết chống lại sự xâm nhập này. Nấm bạch cương khi đó sẽ tông hợp độc tố có tên là bôverixin (beauvericin). Độc tô này sẽ phá vỡ các tê bào bạch huyêt. Khi toàn bộ tẽ bào bạch huyết bị chết cùng là lúc con tăm bị tiêu diệt.

Vai trò nấm bạch cương trong bảo vệ thực vật

Ngoài tằm ra, nấm bạch cương có khả năng giết hàng loạt sâu bệnh. Lần đầu tiên, vào năm 1892, F. Tang đà nuôi cấy thành công nấm bạch cương trên môi trường nhân tạo và dùng bào tử của nấm bạch cương đê tiêu diệt sâu róm (porthetria dispcr).

Sau đó một năm, vào năm 1893, s. A. Forbers, và năm 1896, F. H. Snow đã thành công trong việc sứ dụng bào tử nấm bạch cương để tiêu diệt loài rệp (Blissus leucopteus).

Cơ sở sản xuất nấm bạch cương đầu tiên được xây dựng và được thực hiện tại l rường đại học Kansas, Mỹ. Từ đó đến nay nhiều nước trên thế giới đã tổ chức sản xuất nấm bạch cương dùng trong nông nghiệp để bảo vệ thực vật.

Một số loài côn trùng được xác định là bị tiêu diệt bởi bào tử của nấm bạch cương như sau:

- Aporia crataegi - Aradue cinonamomeus - Araneina sp - Balaninus glandium - Bembidion sp - Blissus leucopterus - Bothynoders punctiventris - Byctisuss sp - Cacoecia crataegana - Carpoeapsa pomonella - Chrysomete sp - Chrysopa vulgaris - Cionus sp - Cleonus sp - Coccínella septempunetala

Cossus cossus - Crambus bonifatellus - Cryptocephalus sp - Eurydema sp - Eurygaster integriceps - Galerucỉnae ruta ' Gnorimo schema ocellatellum - Hopịia sp - Insecta sp

CÓNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT ₁₄₉