L-aminoácido oxidase

de oxidoredutase que ca aminoácido a um -cetoácid 8) e são distribuídas em di (Du e Clemetson, 2002). S variados (Izidoro et al., 20 120–150 kDa (forma nativa anterior realizado por nosso aminoácido oxidase do ven massa de 67 kDa.

Figura 8 – Representação sistemá

Fonte: Yu et al., (2014) modifica

As LAAOs oriunda concentrações e uma variaç (Izidoro et al., 2014). É de razão dos seus efeitos seus et al., 2006).

dase

inoácido oxidases (LAAOs) são flavoenzimas catalisam a desaminação estereoespecífica

cido, com a produção de peróxido de hidrogêni diferentes espécies incluindo insetos, fungos, Suas estruturas, massa molecular e pontos iso

2014). A molécula pode ter aproximadamente iva) ou 55–66 kDa (forma monimerica) (Ali et sso grupo, Torres e colaboradores (2010) isolar eneno total da Bothrops marajoensis obtendo u

mática da reação química catalisada pela L-aminoacido

icada

das de venenos de serpentes (LAAOSV) são iação quantitativa de maneira inter e intraespe descrito que a existência dessas toxinas no ve s protetores contra agentes naturais como paras

as pertencentes à classe a de um substrato L- ênio e amônia (FIGURA

s, bactérias e serpentes isoelétricos são bastante nte massa molecular de et al., 2000). Em estudo laram e purificaram a L-

o uma proteína ácida de

o oxidase (LAAO)

o encontradas em altas pecífica no veneno total veneno total, pode ser a rasitas e bactérias (Ande

De acordo com Macheroux e colaboradores (2001) até meados dos anos 90, os estudos com a LAAOSV eram focados nas análises estruturais e funcionais da molécula, enquanto que nos últimos anos os estudos seguiram para avaliar seus efeitos e potencial farmacológico (Izidoro et al., 2014).

Os efeitos antiparasitários das LAAOs de venenos de diferentes famílias de serpentes têm sido reportados. As ações contra os parasitas da Leishmania donavani e Trypanosoma cruzi e outras espécies, têm sido reportado para venenos da B. moojeni, B. jararaca, B. atrox, B. pirajai e Crotalus viridis (Alves-Paiva et al., 2011; Deolindo et al., 2010; Gonçalves et al., 2002; Izidoro et al., 2006; Stabéli et al., 2004; Tempone et al., 2001).

Em estudo realizado por nosso grupo, demonstramos a ação do veneno da Bothrops marajoensis e sua fração LAAO sobre os parasitas Leishmania amazonensis (Torres et al., 2010). Portanto, o presente trabalho é relevante visando identificar novas moléculas com atividade tripanocida.

2 JUSTIFICATIVA

As doenças parasitárias necessitam de fundamental atenção, tanto devido ao aumento significativo da resistência dos parasitos aos agentes terapêuticos disponíveis, como ao fato de serem comumente classificadas como doenças negligenciadas, as quais afligem países em desenvolvimento e possuem pouco incentivo para a pesquisa, para o desenvolvimento tecnológico e para inovação geradora de produtos necessários à saúde das populações desfavorecidas.

A Doença de Chagas continua sendo um grave problema de saúde pública devido à terapia inadequada e eficácia limitada. Assim, o atual cenário farmacológico aplicado à Doença de Chagas chama a atenção para a necessidade da busca de drogas mais eficazes e com menos efeitos colaterais. Dentro deste contexto,substâncias bioativas de origem animal, podem servir de modelos para serem utilizadas como drogas na terapêutica. O interesse na procura de novas substâncias colocou os venenos animais como uma das mais promissoras fontes de compostos naturais.

As L-amino ácido oxidase são consideradas uma classe de enzimas multifuncionais, portanto, o presente estudo se propõe a avaliar o potencial terapêutico do L-aminoácido oxidase isolada do veneno da Bothrops marajoensis (LAAOBm) sobre as formas epimastigotas, tripomastigota e amastigota de T. cruzi, bem como avaliar o possível mecanismo de ação envolvido na atividade tripanocida e seus respectivos efeitos na fisiologia e morfologia do parasita, na tentativa de identificar novas substâncias que poderão servir de modelos para obtenção de novas drogas para a Doença de Chagas.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Analisar o potencial tripanocida da L-aminoácido oxidase isolada do veneno da Bothrops marajoensis (LAAOBmar) em culturas de cepa Y de Trypanosoma cruzi

3.2 Objetivos Específicos

a. Determinar a atividade enzimática da LAAOBmar por quantificação do peróxido de hidrogênio

b. Determinar a atividade biológica da LAAOBmar sobre as formas epimastigotas e tripomastigotas de T. cruzi na presença e ausência da catalase (CAT).

c. Avaliar a toxicidade da LAAOBmar sobre células de mamíferos LLC-MK2 e determinar o

índice de seletividade.

d. Analisar o percentual de inibição e o índice de sobrevivência de amastigotas de T. cruzi em células LLC-MK2 tratadas com LAAOBmar.

e. Analisar as alterações ultraestruturais induzidas pela ação da LAAOBmar através da microscopia eletrônica de transmissão em formas epimastigotas e tripomastigotas de T. cruzi f. Verificar os possíveis mecanismos de morte celular por citometria de fluxo

g. Analisar os efeitos da LAAOBmar sobre a integridade da membrana plasmática e da mitocôndria de epimastigotas, através da microscopia confocal.

4 MATERIAIS E MÉTODOS

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Cultivo Celular (LCC), Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará com colaborações do Instituto de Biomedicina (IBIMED - UFC) para as análises em microscopia de confocal e do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (FIOCRUZ - Pernambuco) com os experimentos de microscopia eletrônica de transmissão.

4. 1 Amostras

A enzima L-aminoácido oxidase do veneno da Bothrops marajoensis foi cedida pelo Professor Marcos H. Toyama (Universidade Estadual Paulista, Campus do Litoral Paulista) isolada e purificada como descrita por Costa Torres e colaboradores (2010).

O fármaco de referência Benzonidazol (99,5% de pureza), utilizado como controle positivo, foi doado pelo Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco (LAFEPE). As culturas de Trypanosoma cruzi cepa Y e de células LLCM-K2 foram doadas pelo Laboratório

de Bioquímica do Instituto de Química, Universidade de São Paulo.

4. 2 Atividade enzimática LAAOBmar

O ensaio foi realizado com o intuito de se determinar a atividade enzimática da LAAOBmar. Para tanto, utilizamos 10µL de solução enzimática e 90µL/poço de solução de substrato para iniciar a reação como descrito por Kishimoto e Takahashi (2001) com modificações. A mistura da reação padrão continha 250 mM de L-leucina, 2 mM de o- fenilenodiamina (OPD), 0,81 U / ml de peroxidase e LAAOBmar em um volume total de 100 ul / poço de tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0). Após incubação a 37 ° C durante 60 min, a reação foi finalizada por adição de 50 µL de H2SO4 2M. A absorvância da mistura reacional

foi medida a 480 nm, e a atividade foi expressa como o aumento de absorvância. Padrões de peróxido de hidrogénio foram utilizados e os dados calculados por regressão linear sendo a atividade da LAAOBmar expressa como nmoles H2O2/min através do programa GraphPad

4. 3 Cultivos de parasitas e de células de mamíferos

As formas epimastigotas foram cultivadas em meio LIT (Liver infusion tryptose) de acordo com Camargo (1964), suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de antibiótico (penicilina/estreptomicina, Sigma, Brasil) e mantidos a 28°C em incubadora B.O.D (Fanem, Brasil). Os parasitas utilizados para os experimentos foram provenientes de culturas da fase exponencial, obtida através da realização de uma curva de crescimento por contagem diária dos parasitas por 12 dias. Com repiques realizados a cada 7-8 dias.

As formas tripomastigotas foram obtidas por infecção de células LLC-MK2 (Rhesus

monkey kidney). As células foram cultivadas (2 x 105/ mL) em garrafas de cultura celular (25 cm2) em meio MEM (Minimum Essential Medium,Vitrocell, Brasil), suplementado com 10% de soro bovino fetal e, após 48 horas, estágio de semiconfluência, infectadas com suspensão de tripomastigota (1 x 107). As células infectadas foram então mantidas em meio MEM a 2% de soro bovino fetal em atmosfera de 5% de CO2 a 37ºC por 5-6 dias, período em que se

observou a eclosão das células e consequentemente tripomastigotas no sobrenadante. Em seguida, os parasitas foram retirados do sobrenadante, centrifugados (3.500 rpm / 7minutos) e disponíveis para a realização dos ensaios.

As células LLC-MK2 utilizadas para infecção de tripomastigota e para ensaio de

citotoxicidade foram cultivadas em garrafas de cultura celular (25 cm2 ou 75 cm2) em meio MEM suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de antibiótico (penicilina/estreptomicina). A linhagem foi mantida em atmosfera de 5% de CO2 a 37ºC com

visualização diária do crescimento em microscópio óptico invertido.

4. 4 Avaliação da atividade da LAAOBmar sobre as formas epimastigota e