MATERIAL E MÉTODOS
2.2. LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO
O LCE utilizado é constituído de duas passarelas de madeira, dispostas
perpendicularmente, formando uma cruz simétrica (quatro braços de 50cm de
comprimento por lOcm de largura). Dois braços opostos são fechados por
paredes laterais de madeira de 40cm de altura, enquanto os braços restantes
são abertos, circundados por uma borda de Icm de acrílico transparente para
reduzir a ocorrência de quedas. Na junção entre os quatro braços delimita-se
uma área central de 10X10cm. 0 labirinto como um todo é elevado 50cm do
solo. Quatro lâmpadas fluorescentes (15W cada), dispostas igualmente em
forma de cruz, 100 cm acima do labirinto foram utilizadas como única fonte de
iluminação do experimento.
2.3. PROCEDIMENTO
Cada sessão teve início com a cuidadosa colocação do animal no centro
do labirinto, voltado para um dos braços fechados. Permitiu-se ao animal
explorar livremente o labirinto por 5, 2 ou 1 minuto. Vinte e quatro horas após a
primeira exposição, os animais receberam salina ou midazolam (MDZ 1,5mg/Kg,
ROSA et al., 2000) via intra-peritoneal (ip). Trinta minutos após a injeção todos
foram submetidos a uma segunda exposição ao LCE, com duração de 5
minutos (Tabela 5).
As variáveis comportamentais analisadas foram: número (A) e
porcentagem de entradas (%A) nos braços abertos, porcentagem de tempo de
permanência nos braços abertos (%T), bem como o número de entradas nos
braços fechados (F) e total de entradas (T). “Entrada” e “Saída” dos braços
foram definidas como a colocação das quatro patas do animal dentro ou fora de
um braço, respectivamente.
Com a finalidade de evitar pistas odoríferas, após cada teste o labirinto foi
limpo com tecido umedecido em uma solução de álcool 20%. A eventual queda
de um animal do labirinto implicou necessariamente na exclusão do mesmo.
Aprendizado no LCE_______________________________ Maria Luiza Cleto Dal-Cól
TABELA 5. Grupos experimentais, com relação à exposição ao labirinto, droga/veículo, e o tempo de duração da primeira e da segunda sessão.
GRUPO PRIMEIRA EXPOSIÇÃO
(sem droga) SEGUNDA EXPOSIÇÃO SAL ou MDZ 5 5 min 5 min 2 2 min 5 min 1 1 min 5 min 2.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram analisados por análise de variância de duas vias (Two-
way ANOVA) seguida do teste de Newman-Keuls para múltiplas comparações.
Apenas valores com p<0,05 foram considerados significantes.
Aprendizado no LCE____________________________ Maria Luiza Cleto Da|-C^
RESULTADOS
CAPÍTULO III - RESULTADOS
A figura 4 mostra a porcentagem de entradas nos braços abertos (%A;
gráfico A) e a porcentagem de tempo despendido nos braços abertos (%T;
gráfico B) de ratos submetidos à primeira exposição (E1) com duração de 5, 2
ou 1 minutos e segunda exposição de 5 minutos (E2) no labirinto em cruz
elevado (LCE), com administração de salina.
O teste de Newman-Keuls para múltiplas comparações revelou que a
porcentagem de entradas nos braços abertos (%A) durante a segunda
exposição esteve reduzida quando os ratos foram previamente expostos ao
LCE por 2 minutos (p<0,05). Quando os animais foram previamente expostos
ao LCE por 5 minutos, a porcentagem de entradas nos braços abertos (%A)
também mostraram-se reduzidas, porém não atingiram significância estatística
(p=0,0557). Os ratos submetidos à primeira exposição de 1 minuto
apresentaram uma porcentagem semelhante de entradas nos braços abertos
(%A) durante as duas exposições.
A porcentagem de tempo despendido nos braços abertos (%T) esteve
reduzida na segunda exposição, independentemente da duração da primeira
exposição (1, p<0,05; 2, p<0,001 e 5 minutos, p<0,05) ao LCE.
Aprendizado no LCE Maria Luiza Cleto Dal-Cól ®E1 d E2 A 50 -j (0
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Q)DURAÇÃO DA PRIMEIRA EXPOSIÇÃO (min.)
FIGURA 4. Porcentagem de entradas nos braços abertos (%A; gráfico A) e porcentagem de tempo despendido nos braços abertos (%T; gráfico B) na primeira exposição (E1) com duração de 5, 2 ou 1 minutos e segunda exposição de 5 minutos (E2) no labirinto em cruz elevado (LCE) com administração de salina í.p., previamente à E2. Dados apresentados na forma de média ±E.P.M.: *p<0,05 e **p<0,001 em relação à primeira exposição. (Two- Way ANOVA seguida do Teste de Newman=Keuls para múltiplas comparações)
A figura 5 representa o número de entradas nos braços abertos (gráfico
A) e fechados (gráfico B), assim como o total de entradas (gráfico C), na
primeira e na segunda exposição, dos ratos submetidos à primeira exposição
com diferentes durações e reexpostos ao LCE 24 horas depois, com
administração de salina previamente á E2. O teste de Neuman-Keuls revelou
que os ratos expostos a 5 minutos de primeira exposição apresentaram maior
número de entradas nos braços abertos (p<0,05), fechados (p<0,05), e
conseqüentemente total (p<0,001), quando comparados ao grupo exposto a 1
minuto de primeira exposição; além disso, a primeira exposição de 5 minutos
induziu menor número de entradas nos braços abertos na segunda exposição
(p<0,05), mas não diminuiu o número de entradas nos braços fechados e o
total de entradas durante a segunda exposição.
Aprendizado no LCE Maria Luiza Cleto Dal-Cól È(Q 8 3 S « 2 z 0 ®E1 □ E2 B w « ■o SS
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»-DURAÇÃO DA PRIMEIRA EXPOSIÇÃO (min.)
FIGURA 5. Número de entradas nos braços abertos (A), braços fechados (B) e total de entradas (C) na primeira exposição (E1) com duração de 5, 2 ou 1 minutos, e segunda exposição (E2) de 5 minutos ao labirinto em cruz elevado, com administração de salina previamente à E2. Dados apresentados na forma de média mais E.P.M.: *p<0,05 com relação à primeira exposição; #p<0,05 e ## p<0,001 com relação à primeira exposição de 1 minuto. (Two-Way ANOVA seguida do Teste de Newman-Keuls para múltiplas comparações)
A figura 6 apresenta a porcentagem de entradas nos braços abertos
(%A; gráfico A) e a porcentagem de tempo despendido nos braços abertos
(%T; gráfico B) de ratos não tratados, submetidos à primeira exposição (E l)
com duração de 5, 2 ou 1 minutos, e após 24 horas, tratados com midazolam
ou salina (i.p.) 30 minutos antes da segunda exposição (E2) ao labirinto em
cruz elevado (LCE). 0 teste de Newman-Keuls revelou que no grupo com
primeira exposição de 1 minuto, o tratamento com Midazolam prévio à segunda
exposição induziu aumento na porcentagem de entradas nos braços abertos
(%A; p<0,05) e na porcentagem de tempo despendido nos braços abertos (%T;
p<0,05) na segunda exposição, quando comparado ao grupo tratado com
salina. Nos grupos cuja primeira exposição ao LCE foi de 2 ou 5 minutos, o
Midazolam não alterou a porcentagem de entradas nos braços abertos (%A) e
tempo despendido nos braços abertos (%T) na segunda exposição, em
comparação ao grupo salina. Além disso, a %A e %T mostraram-se diminuídas
na segunda exposição nos grupos submetidos à E1 de 2 e 5 minutos (p<0,05),
em comparação ao grupo submetido à primeira exposição de 1 minuto tratado
com Midazolam previamente à segunda exposição.
A figura 7 mostra o número de entradas nos braços abertos, fechados, e
o total de entradas dos ratos expostos a E1 de 1, 2 ou 5 minutos, e tratados
com salina ou midazolam 30 minutos antes da segunda exposição. O teste de
Newman-Keuls revelou que no grupo submetido a um minuto de primeira
exposição, 0 tratamento com midazolam aumentou o número de entradas nos
braços abertos durante a segunda exposição, com relação ao grupo tratado
com salina (p<0,05), enquanto o número de entradas nos braços fechados e
Aprendizado no LCE Maria Luiza Cleto Dal-Cól
total permaneceram inalterados. Nos grupos submetidos à primeira exposição
de 2 ou 5 minutos, que receberam midazolam previamente à segunda
exposição, o número de entradas nos braços abertos encontrou-se diminuído,
quando comparado ao grupo MDZ exposto a 1 minuto de E1 (p<0,05).
Todos os dados são apresentados na forma de média e desvio padraão,
nos anexos 1, 2, 3, 4 e 5. (0 -§<0 (0 (0 50 - 40 - A # 8i 30 ss u> (0 ■o ÍS c 0> 20 10 - I 30
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FIGURA 6. o gráfico apresenta a média +E.P.M da porcentagem de entradas nos braços abertos (%A; gráfico A) e porcentagem de tempo despendido nos braços abertos (%T; gráfico B). Ratos foram inicialmente submetidos a uma exposição com duração de 1, 2 ou 5 minutos. Previamente à segunda exposição, os animais foram tratados com salina ou midazolam (1,5mg/kg) i.p.. Two-Way ANOVA seguida do Teste de Newman-Keuls para múltiplas comparações: ^p<0,05 com relação ao grupo salina; ®p<0,05 em relação ao grupo com primeira exposição de 1 minuto.
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DURAÇÃO DA PRIMEIRA EXPOSIÇÃO (min)
FIGURA 7. Número de entradas nos braços abertos (A) e fechados (B) e total de entradas (0). Ratos foram inicialmente submetidos a uma exposição com duração de 1, 2 ou 5 minutos. Previamente à segunda exposição, os animais foram tratados com salina ou midazolam (1,5mg/kg) i.p.. Two-Way ANOVA seguida do Teste de Newman-Keuls para múltiplas comparações: com relação ao grupo salina; ®p<0,05 em relação ao grupo com primeira exposição
de 1 minuto.
Os dados referentes à primeira versus segunda exposições dos grupos
que receberam MDZ previamente à segunda exposição não são apresentados
na forma de gráfico devido à existência de duas variáveis independentes: a
administração ou não de droga (realizada apenas previamente à E2), e a
exposição (primeira X segunda).
Todos os dados obtidos são apresentados na forma de média e desvio
padrão em tabelas, nos Anexos 1, 2, 3, 4 e 5.
Aprendizado no LCE_______________________________Maria Luiza Cleto Dal-Cól
DISCUSSÃO
Aprendizado no LCE_________________________ Maria Luiza Cleto Dal-Cól
CAPÍTULO IV - DISCUSSÃO
As hipóteses para a perda de efeito ansiolítico dos benzodiazepínicos na
segunda exposição ao LCE têm variado entre “one-trial tolerance”, ou seja,
tolerância à droga (FILE, 1990), habituação locomotora (DAWSON et al.,
1994), e uma mudança de ansiedade experimental na segunda exposição
(FILE & ZANGROSSI, 1993a e 1993b), contra a qual os benzodiazepínicos não
são clinicamente efetivos. Análise fatorial tem mostrado que os índices de
ansiedade referentes à primeira e à segunda exposição ao LCE são
matematicamente fatores independentes (FILE etal., 1993).
A análise minuto a minuto do comportamento de ratos no labirinto em
cruz elevado realizada em nosso laboratório (ROSA et al., 2000) e de
camundongos, realizada por RODGERS (1996) mostrou significativa redução
na exploração dos braços abertos (tanto em porcentagem de tempo, quanto de
entradas nos braços abertos) no labirinto nos minutos finais da primeira
exposição, assim como em todos os minutos da segunda exposição. Além
disso, a ação do midazolam (MDZ), cujo efeito ansiolítico reflete-se no aumento
da exploração dos braços abertos do labirinto, decai a partir do terceiro minuto
(ROSA et al., 2000), além de perder efeito na segunda exposição ao labirinto
(FILE, 1990).
A diminuição da exploração dos braços abertos e a perda do efeito
ansiolítico no decorrer da sessão experimental (ROSA et al., 2000) e nas
subseqüentes exposições (FILE, 1990) têm sido consideradas, então,
decorrentes de um aprendizado desenvolvido durante a primeira exposição do
animal ao labirinto (FILE, 1993c; ROSA etal., 2000).
No presente estudo, a comparação dos grupos que receberam salina
não mostrou diferença significativa na porcentagem de entradas nos braços
abertos e na porcentagem de tempo nos braços abertos tanto comparando-se
as primeiras exposições, quanto comparando as segundas exposições, o que
sugere semelhante nível de ansiedade entre os grupos em ambas as
exposições. Entretanto, comparando-se a primeira com a segunda exposição
de cada grupo, observou-se que nos grupos submetidos a cinco ou dois
minutos de primeira exposição ao LCE, houve diminuição na porcentagem de
entradas nos braços abertos (significantemente apenas no grupo 2 minutos) e
na porcentagem de tempo nos braços abertos na segunda exposição. Estes
dados sugerem um maior nível de ansiedade na segunda exposição,
provavelmente devido a uma aprendizagem durante a primeira exposição.
(FILE & ZANGROSSI, 1993b; RODGERS, 1996; ROSA et a i, 2000;
BERTOGLIO & CAROBREZ, 2000).
A modificação na porcentagem de entradas nos braços abertos da
primeira exposição de dois minutos para a segunda exposição corrobora os
resultados obtidos por RODGERS (1996) em experimento com camundongos,
destacando a importância dos minutos iniciais no aumento da esquiva e
ausência de efeito ansiolítico dos benzodiazepínicos na segunda exposição ao
LCE.
Em nosso estudo, no grupo submetido a um minuto de primeira
exposição verificou-se apenas diminuição na porcentagem de tempo nos
braços abertos. Observando a porcentagem de entradas nos braços abertos,
no mesmo grupo, podemos verificar a manutenção do comportamento da
primeira para a segunda sessão, o que pode suscitar dúvidas sobre a
ocorrência do aprendizado de aumento da esquiva dos braços abertos com
apenas um minuto de primeira exposição.
Como as drogas benzodiazepínicas perdem seu efeito ansiolítico no
labirinto em cruz elevado a partir do terceiro minuto de exposição (ROSA et al.,
2000) e são inefetivas na segunda exposição ao labirinto (FILE, 1990), os
animais foram submetidos à administração sistêmica de midazolam (MDZ)
previamente à segunda exposição, associada à redução no tempo de primeira
exposição. Com isto objetivamos verificar se essa redução no tempo de
primeira exposição impediria ou não o aprendizado que se reflete na perda de
efeito do midazolam. Verificamos, assim, que os animais que tiveram seu
tempo de exposição ao labirinto reduzido para um minuto na primeira
exposição apresentaram efeito ansiolítico do midazolam na segunda
exposição, ou seja, maior porcentagem de entradas e de tempo de
permanência nos braços abertos na segunda exposição, com relação ao
controle. Essa presença de efeito ansiolítico do midazolam sugere não haver
ocorrido o aprendizado na primeira exposição de apenas um minuto.
A presença de efeito ansiolítico do midazolam na segunda exposição
associada ao fato de não haver redução na exploração dos braços fechados na
segunda exposição, demonstra também não ter ocorrido habituação locomotora
no labirinto. Isso corrobora a literatura, pois estudos demostram que além de
não ocorrer diminuição no número de entradas nos braços fechados na segunda
exposição, não há adaptação na liberação de corticosterona (FILE et al., 1994;
FILE ef a/., 1999).
Aprendizado no LCE_______________________________ Maria Luiza Cleto Dal-Cól
Segundo BERTOGLIO & CAROBREZ (2000), a exploração dos dois tipos
de braços do labirinto (abertos e fechados) em uma mesma exposição é
essencial para o aprendizado no labirinto. Assim, a expressão de ansiedade no
labirinto não está relacionada apenas à aversividade dos braços abertos, mas
sim ao conflito gerado pela comparação, entre a pulsão de exploração e de
esquiva. É possível, então, que a ausência do aumento da esquiva dos braços
abertos e a presença de efeito ansiolítico do midazolam na segunda exposição,
verificado nos animais com apenas um minuto de primeira exposição, seja
devido à menor possibilidade de exploração, e conseqüentemente de
comparação, entre dos braços abertos e fechados do labirinto.
Segundo FILE et al. (1999), na primeira exposição, a principal fonte de
aversividade é a natureza dos braços abertos, porém na segunda exposição, a
altura do labirinto seria o fator aversivo. 0 núcleo basolateral da amígdala tem
sido considerado o substrato neural para aquisição e consolidação da
informação adquirida durante a primeira exposição (FILE et al., 1998).
LAMPREA et al. (2000) demonstrou que animais com lesão no septo não
apresentam modificações no comportamento na primeira exposição ao LCE,
porém na segunda exposição demonstram menores índices de ansiedade que
os controles, isso sugere que a lesão do septo interfere no aprendizado sobre o
ambiente (no caso o labirinto) durante a primeira sessão. Assim, o sistema
septo-hipocampal parece envolvido na aquisição e consolidação das mudanças
comportamentais da primeira para a segunda exposição ao labririnto em cruz
elevado.
O fato de um minuto de primeira exposição ser insuficiente para a
aquisição do aprendizado no LCE, evidenciando presença de efeito ansiolítico
do midazolam no LCE na segunda exposição, corrobora a literatura no que diz
respeito à ausência de tolerância á droga a partir da segunda exposição (FILE &
ZANGROSSI, 1993b; RODGERS et a i, 1996; ROSA et a i, 2000; BERTOGLIO
& CAROBREZ, 2000; TREIT et a i, 1993), e reforça a necessidade de
modificação e não-utilização do termo "One-trial tolerance” como descritivo do
fenômeno.
A literatura tem proposto que o aumento da esquiva dos braços abertos e
a ausência de efeito ansiolítico do midazolam na segunda exposição são frutos
do aprendizado de um medo condicionado, possivelmente um estado fóbico
(FILE& ZANGROSSI, 1993b; FILE, ZANGROSSI, VIANA & GRAEFF, 1993c;
FILE, GONZALEZ, L.E. & GALLANT, 1998). Assim, nossos resultados
corroboram a literatura no que diz respeito à atribuição do fenômento a uma
modificação intrínseca ao animal, o aprendizado (condicionamento). Através da
delimitação de nosso estudo verificamos uma alteração funcional do organismo,
necessária à sobrevivência do animal. Este estudo não nos permite realizar
correlação com um ou outro distúrbio de ansiedade verificado na clínica.
A análise temporal, ou curva de aprendizado verificada através da
redução do tempo do animal ao labirinto na primeira exposição indica que o
Labirinto em Cruz elevado, assim como o labirinto em “T” elevado, pode ser
uma ferramenta para o estudo de aprendizado e memória emocional.
Aprendizado no LCE_______________________________ Maria Luiza Cleto Dal-Cól
CONCLUSÃO
Aprendizado no LCE___________________ ___________Maria Luiza Cleto Dal-Cól
CAPÍTULO V - CONCLUSÃO
õ Reduzido tempo de exploração do LCE impede a aquisição do
aprendizado do aumento da esquiva dos braços abertos em ratos na
segunda exposição.
õ 0 Midazolam apresenta efeito ansiolítico na segunda exposição quando
a redução no tempo de exploração do LCE impede a aquisição do
aumento da esquiva dos braços abertos.
õ 0 aumento da esquiva dos braços abertos e ausência de efeito
ansiolítico do midazolam na segunda exposição ao LCE podem ser
decorrentes de aprendizagem emocional durante a primeira exposição a
LCE.