Lacases

As lacases (benzenediol oxigénio oxidoredutase, EC 1.10.3.2) são oxidoredutases com um grande potencial em aplicações industriais e ambientais (Sousa et al., 2013; Pereira et al., 2009a). Estas enzimas pertencem à grande família das oxidases de multi-cobre (MCO), e catalisam a oxidação de vários compostos aromáticos, nomeadamente fenólicos, e inorgânicos, com a redução simultânea de oxigénio a água, em soluções aquosas, resultando em reações “amigas do ambiente “ e de baixo custo (Khan et al., 2013; Sousa et al, 2013; Solís et al., 2012; Pereira et al., 2009a).

As enzimas deste grupo foram descritas, pela primeira vez, por Yoshida, em 1883, após observação do rápido endurecimento da resina de Rhus vernificera, uma árvore que prolifera no Japão, em contacto com o ar. Dez anos depois, após ser isolada e purificada, a enzima foi denominada lacase. Já foram identificadas lacases em várias plantas, vegetais, frutos e em vários géneros de insetos, como Bombyx, Drosophilia, Musca, Lucilia entre outros. Também já foram identificadas lacases em vários fungos, como Basidiomycetes e bactérias como Bacillus subtilis (Fu et al., 2013; Mandhavi & Lele, 2009).

As lacases são proteínas com quatro átomos de cobre presentes nos centros catalíticos das lacases: T1 é um centro ativo mononuclear envolvido na oxidação do substrato e é responsável pela cor azul da enzima; já T2 e T3 formam um centro trinuclear envolvido na redução do oxigénio a água. Desta forma, o cobre do centro ativo T1 oxida o substrato e transfere esses eletrões para os centros ativos T2 e T3, que irão ser usados para reduzir o oxigénio a água (Grover et al., 2013; Pereira et al., 2009b; Enguita et al., 2004).

31 Na Figura 1-9 está representado o mecanismo enzimático destas enzimas, para substratos fenólicos:

Figura 1-9. Mecanismo enzimático da lacase (adaptado de Grover et al., 2013).

Usando os domínios ativos, a lacase oxida os substratos, captando os eletrões e usando-os para a redução do oxigénio a água. Geralmente, as lacases reagem com substratos fenólicos, que perdem um eletrão e um protão, formando radicais livres, que são estabilizados por ressonância. Estes radicais são depois envolvidos em acoplamentos covalentes, originando espécies poliméricas. Tipicamente, uma mole de lacase é oxidada pelo oxigénio e, por sua vez, oxida quatro moles do seu substrato fenólico, formando um radical fenoxilo (Grover et al., 2013; Sousa et al., 2013; Cañas & Camarero, 2010).

Entre os compostos fenólicos, que já foram referidos como substratos das lacases, estas enzimas também oxidam lenhinas, fenóis metóxi-substituídos e aminas aromáticas. Também descoloram alguns corantes azo, sem que ocorra a clivagem direta da ligação azo, através de um mecanismo não específico, que envolve a formação de radicais, resultando em dímeros e olígomeros evitando-se, assim, a formação de aminas aromáticas potencialmente tóxicas (Solís

et al., 2012; Pereira et al., 2009; Zhukhlistova et al., 2008; Hullo et al., 2001).

As lacases possuem um grande potencial em processos biotecnológicos principalmente devido aos processos de oxidação não específicos, à não necessidade de uso de cofatores, sendo que o oxigénio é o aceitador de eletrões, e por serem bastante estáveis (Khan et al., 2013; Solís

et al., 2012; Pereira et al., 2009a).

As lacases são usadas em várias indústrias. Na indústria alimentar, são usadas na eliminação de compostos fenólicos indesejáveis, responsáveis pela cor acastanhada e turbidez dos sumos de

Formação de polímeros

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fruta, cerveja e vinho. Na indústria do papel, em processos de remoção de lenhina; na indústria têxtil, são usadas em processos de branqueamento e até em síntese de corantes; na nanobiotecnologia, estas enzimas têm sido estudadas como biossensores de compostos fenólicos, como morfina e codeína. As lacases também são usadas na biorremediação de solos, nomeadamente na degradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, como o 2,4,6- trinitrotolueno (TNT), em síntese química e em cosméticos (Couto & Herrera, 2006).

1.5.2.1. Lacase de Bacillus subtilis (CotA-lacase)

Os endósporos bacterianos são estruturas de resistência contra fenómenos físico-químicos extremos, como raios-UV, calor ou agentes oxidantes. A bactéria Bacillus subtilis é produtora de endósporos, que estão envolvidos por uma capa (“coat”) rica em proteínas, que também influencia a germinação dos esporos. Esta capa é constituída por mais de trinta polipéptidos, cuja massa molecular varia entre os 5 e os 65 kDa. Uma das enzimas que aparece associada à

capa é a enzima CotA, uma proteína monomérica com peso molecular de ~65 kDa (Enguita et al., 2002; Martins et al., 2002).

A estrutura molecular da CotA é semelhante à das lacases, enzimas pertencentes à família das MCO (Hullo et al., 2001). A estrutura da enzima é composta por três domínios e inclui um centro de cobre mononuclear no domínio T1 e um centro trinuclear entre os domínios T2 e T3. Esta enzima manifesta uma cor azul a um comprimento de onda de 600 nm (Silva et al., 2012; Martins et al., 2002).

Na Figura 1-10 estão representados os três domínios da CotA-lacase, a sua estrutura tridimensional e a enzima cristalizada:

33 Figura 1-10. (a) Estrutura tridimensional da CotA-lacase. Os terminais C e N estão representados, bem como

os locais de entrada do substrato e saída do produto. Os centros de cobre estão representados a amarelo (adaptado de Durão et al., 2006); (b) Organização estrutural do centro catalítico da CotA-lacase (Durão et al.,

2006); (c) Cristal de CotA-lacase. A cor azul é característica da presença de cobre no domínio T1 (Martins et

al., 2002).

A CotA-lacase é extremamente termoestável, manifestando atividade a uma temperatura de 80 °C durante 2-4 horas; já a lacase do fungo Chaetomium thermophilium mantém a atividade durante 8 minutos, à mesma temperatura (Zhukhlistova et al., 2008; Martins et al., 2002). Uma outra vantagem do uso da CotA-lacase é o facto de esta não necessitar de mediadores redox para a descoloração de uma grande variedade de corantes estruturalmente diferentes e apresentar uma atividade ótima em pH alcalino, o que já não acontece com lacases de origem fúngica (Pereira et

al., 2009a). Saída Entrada B A C

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