Leishmaniose canina

A Leishmaniose é uma das doenças infeciosas do mundo mais preocupantes e encontra-se difundida no Mediterrâneo, África, Médio Oriente, Ásia e América do Sul. É transmitida através da picada de um mosquito do género Phlebotomus e é uma doença sistémica grave, de curso lento e crónico.

Os parasitas do género Leishmania são responsáveis pela doença e apresentam duas formas no seu ciclo de vida: uma forma promastigota flagelada encontrada no trato digestivo do vector (flebótomo), e uma forma amastigota, que se desenvolve no interior dos macrófagos dos hospedeiros vertebrados. Apenas as fêmeas dos mosquitos Phlebotomus transmitem a doença através da picada na pele dos hospedeiros, com a consequente inoculação dos promastigotas na corrente sanguínea. Os parasitas são então interiorizados pelos macrófagos e transformam-se na forma amastigota, perdendo o flagelo. No hospedeiro, sobrevivem e multiplicam-se numa relação de parasitismo complexa. Existem mais de vinte espécies de Leishmania e cada uma apresenta exigências ecológicas, vectores e hospedeiros diferentes [57].

A Leishmaniose apresenta três síndromas clínicos: leishmaniose cutânea, muco cutânea e visceral, esta última também conhecida como "Kala azar". A Leishmaniose Visceral (VL - Visceral Leishmaniasis) apresenta elevada taxa de mortalidade em humanos infectados e é considerada como um grave problema de saúde pública em vários países (ver Figura 1.7) [58].

A VL é causada por duas espécies, Leishmania donovani e Leishmania infantum, dependendo da área geográfica. L. infantum é responsável pela difusão da doença na Europa, norte de África e América Latina e infecta principalmente crianças e indivíduos imunossuprimidos. L.donovani infecta todas as faixas etárias e encontra-se difundida pelo leste de África e Índia. Após um período de incubação entre dois e seis meses, os pacientes infetados com VL apresentam sintomas e sinais persistentes de infeção que incluem febre, fatiga, fraqueza, perda de apetite e de peso. A proliferação do parasita para o sangue e sistema reticuloendotelial manifesta-se no aumento dos nódulos linfáticos, baço e fígado. Os sintomas persistem durante várias semanas e até meses antes que o paciente procure aconselhamento médico. A doença pode provocar a morte do paciente devido a infeções bacterianas, hemorragias graves ou anemia severa [59].

Figura 1.7: Mapa mundial das zonas onde a Leishmaniose Visceral é endémica (A) [59]. Imagem obtida por microscopia de varrimento electrónico de uma forma promastigota de Leishmania (B) e mosquito do género

A doença é endémica maioritariamente em países pouco desenvolvidos ou em regiões rurais remotas. Pacientes e familiares afetados pela VL veem o seu nível económico diminuir devido a custos diretos da doença, como custos de diagnóstico e tratamento, e custos indiretos, relacionados com fatores como perda do trabalho e habitação. Estima-se que por ano surjam 500.000 novos casos de VL e que a doença seja responsável pela morte de 50.000 pessoas anualmente, uma taxa que, entre as doenças parasitárias, apenas é ultrapassada pela malária [59].

Na bacia Mediterrânica os casos de Leishmaniose humana são mais comuns em crianças mas, com o aparecimento da SIDA, a Leishmaniose tornou-se uma complicação comum em adultos infetados com o HIV ou que se encontrem a tomar fármacos imunossupressores [57].

O diagnóstico e tratamento precoce da VL são considerados uma ferramenta essencial no controlo da doença. São essenciais não só para os pacientes como para a comunidade, pois os pacientes não tratados contribuem para a transmissão da doença. Sendo uma infecção zoonótica, também para a medicina veterinária estes componentes são de extrema importância, especialmente porque o cão é considerado o hospedeiro principal do parasita.

Como a apresentação clínica da VL não é específica, a necessidade de um teste que confirme quais os pacientes que devem receber tratamento é crucial. Estes testes deverão ser sensíveis, uma vez que a doença é fatal e as terapias atualmente disponíveis envolvem medicamentação tóxica. Por outro lado, tendo em conta as características dos locais endémicos da doença, os testes deverão também ser simples e económicos [59].

A detecção visual do parasita ao microscópio, apesar de ter uma elevada especificidade, depende da sensibilidade do tecido usado, implica a obtenção de biopsias potencialmente dolorosas (medula óssea, fígado e baço) e a disponibilidade de técnicos e equipamentos hospitalares especializados.

Os testes serológicos para a leismaniose baseiam-se na detecção indireta, ou seja, na detecção de anticorpos anti-leishmania no soro dos pacientes infetados. Existem atualmente vários testes serológicos disponíveis para o diagnóstico da VL, tais como os baseados na imunofluorescência indireta (IFA) e em ensaios ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) que demonstram resultados precisos, mas não são práticos para utilização em meios não laboratoriais [60]. Dois testes serológicos foram especificamente desenvolvidos para utilização no terreno: o teste de aglutinação direta (DAT -

Direct Agglutination Test) e o teste imunocromatográfico rK39 (ICT - rK39-based immunochromatographic test) [61]. O antigénio rK39 é uma repetição de 39 aminoácidos que faz parte

de uma proteína do complexo L. donovani, que demonstrou excelente sensibilidade e especificidade no diagnóstico da VL (Figura 1.8) [62]. O ICT foi desenvolvido como um ensaio imunológico de fluxo lateral, formato bastante prático para uso POC.

Figura 1.8: Teste de diagnóstico serológico imunocromatográfico com base no antigénio rK39 para Leishmaniose Visceral (adaptado de [59]).

O objetivo deste projeto, no que diz respeito ao biossensor para diagnóstico da Leishmaniose Canina, resume-se à implementação de um dispositivo de fluxo lateral que utiliza como suporte o papel. A substituição da membrana de nitrocelulose, usada nos sistemas comerciais, por papel visa a redução dos custos do produção, transporte e armazenamento dos testes, mantendo as propriedades que tornam este tipo de dispositivo simples e prático para uso no terreno. Pensa-se que as propriedades do papel poderão reduzir o número de componentes do dispositivo (ver Figura 1.9), nomeadamente, eliminando a necessidade de um suporte e encapsulamento plástico, uma vez que o papel é bastante mais resistente que a membrana de nitrocelulose, assim como pode ser adaptado para funcionar como bloco de depósito da amostra, de conjugação e de absorção, simultaneamente.

Figura 1.9: Componentes de um dispositivo de fluxo lateral (adaptado de [41]).

O dispositivo foi implementado usando como modelo a Leishmaniose canina e o seu funcionamento baseia-se na detecção indireta de anticorpos anti-Leishmania no soro de animais infetados, utilizando como transdutor nanopartículas de ouro funcionalizadas com proteína A. A proteína A estabelece uma ligação forte com a parte comum de todos os anticorpos de várias espécies, entre as quais se inclui o cão.

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Técnicas de Caracterização