p I = Valor do teste entre os grupos B e A para cada tempo de avaliação.
Obs 3: Se as letras gregas entre parêntesis são distintas existe diferença significante entre os grupos correspondentes no tempo de avaliação de 4 meses.
Para o grupo que recebeu apenas o carcinógeno (Grupo A), as médias do escores aumentaram com o tempo de avaliação (p<0,05) e através das comparações pareadas do teste de Mann-Whitney comprovou-se diferença significante entre cada um dos tempos. Ao compará-lo ao grupo controle, diferenças significantes foram registradas para cada tempo de avaliação (p< 0,05).
Nos grupos D e E, a média dos escores reduziu com o tempo de avaliação, entretanto sem diferença significante entre os tempos (p > 0,05). Ao compará-los aos seus respectivos controles, grupos B e C, foram observadas diferenças significantes para cada tempo (Tabela 3), exceto o grupo D, no qual só houve diferença estatisticamente significante com 4 meses de aplicação do carcinógeno (p<0,05). A análise estatística também mostrou que o laser de 660nm influenciou o processo da carcinogênese de forma semelhante ao de 780nm (p>0,05).
Entre os grupos experimentais A, D e E observou-se que na avaliação com 2 meses a média mais elevada ocorreu no grupo D, enquanto que nas avaliações com 3 e com 4 meses as médias mais elevadas ocorreram no grupo A. No entanto, diferença significante entre os três grupos experimentais foi registrada apenas para o tempo de 4 meses (p<0,05), no qual o grupo A obteve a maior média dos escores. (Tabela 3).
Não se comprovou diferenças entre os grupos E3 e F (p>0,05), o que mostra que não houve influência no processo de indução da carcinogênese quando o laser de 780nm foi aplicado 4 vezes na semana durante 4 meses ou apenas 6 irradiações durante 1 semana.
DISCUSSÃO
Várias lesões orais são de relevância particular para o câncer oral: leucoplasia, líquen plano, eritroplasia e eritroleucoplasia. De acordo com Tsantoulis et al. (2007)21 aproximadamente 10 a 15% das leucoplasias orais são diagnosticadas como displasia leve a moderada e outras 5% podem ser diagnosticadas como displasia severa ou carcinoma in situ. A eritroplasia oral é
rara, mas tem um alto risco de progressão para o câncer (14 a 50%) e é freqüentemente diagnosticada histologicamente como displasia epitelial severa ou carcinoma in situ. Nesse estudo houve a formação de lesões leucoplásicas e eritroleucopásicas, as quais estavam associadas histologicamente aos diversos graus de displasia epitelial e em alguns casos ao desenvolvimento do carcinoma in situ e superficialmente invasivo.
A associação dos achados clínicos e histopatológicos em cada grupo é condizente. No grupo A, por exemplo, quanto maior o tempo de aplicação do carcinógeno foi verificada a maior ocorrência de eritroplasia associada às alterações epiteliais mais severas. Enquanto que nos grupos que receberam carcinógeno e laser houve uma tendência ao desenvolvimento de alterações displásicas mais brandas associadas clinicamente a lesões brancas, à medida que se prolongou o período de indução carcinogênica.
A partir da comparação do grupo que recebeu apenas o carcinógeno com o grupo controle, podemos afirmar que tanto as alterações clínicas como histopatológicas mostraram que a severidade aumentou, quanto mais longo o tempo de exposição ao 4NQO. Este fato está de acordo com vários autores15,17,22 que relataram ainda que o surgimento de carcinomas é lento, em torno de 4 a 5 meses de indução carcinogênica. Acreditamos que as alterações foram mais severas no terço anterior devido à aplicação tópica direta e repetida na região e na parte posterior pelo contato constante do 4NQO durante a sua ingestão pelo animal, o que corrobora com os achados de (VERED et al., 2007)13.
Dessa forma, fica evidente para o grupo A, a associação da progressão das alterações epiteliais displásicas com o aumento do período de aplicação do
carcinógeno, o que explica o desenvolvimento de um carcinoma superficialmente invasivo no grupo A3 23,24,25 . No entanto, este fato não foi visto nos grupos que receberam a irradiação laser associada à indução da carcinogênese (grupos D, E e F). Ao contrário do grupo A, nos grupos D, E e F as alterações epiteliais foram mais discretas e não mostrou uma progressão significante com o tempo.
Adicionalmente, não foi verificado efeito distinto no processo da carcinogênese entre as amostras irradiadas com 660 e 780nm de comprimento de onda. No entanto, as alterações epiteliais proporcionadas no grupo que recebeu carcinógeno e laser 780nm quando comparadas ao controle foram significantes para todos os tempos de avaliação, enquanto que para o grupo que recebeu 660nm só houve diferença significante com relação ao seu controle, com 4 meses de indução da carcinogênese. Para o grupo que recebeu o laser 4 vezes na semana junto ao carcinógeno durante 4 meses (Grupo F), não foi obtido nenhum resultado diferenciado, ele mostrou-se com alterações semelhantes aos grupos D e E.
Na realidade esperava-se que a irradiação laser proporcionasse um agravamento das alterações displásicas e uma progressão das fases da carcinogênese, já que a luz laser mostra em diversos estudos, uma ação biomodulatória positiva no processo de proliferação de células benignas e malignas4,7,8,9,26. Além disso, é relatado que a laserterapia promove um aumento na produção de oxigênio singleto27 e fatores de crescimento28, os quais incrementam ainda mais a proliferação celular.
Sabe-se que o 4NQO promove alterações moleculares e histológicas antes mesmo das alterações clínicas24,29. Então, é possível que o tecido nos
grupos D, E e F tenha se tornado displásico, contudo sem solução de continuidade. Logo, o laser não teve efeito significativo, já que ele atua apenas em tecido danificado30. Isso explica o seu efeito cicatrizante em ulcerações aftosas, ulcerações traumáticas, herpes e queilite angular31 e mucosite32.
De acordo com Karu (1989)30, se o tecido é completamente funcional no momento da irradiação, não existe nada para a irradiação laser estimular e nenhum efeito cicatrizante, ou seja, proliferação celular será observada. No entanto, se o tecido estiver danificado, a irradiação tentará estimular o reparo.
Além disso, o estímulo a proliferação de células tumorais depende da taxa de mitose no momento da irradiação33. Nos grupos que receberam carcinógeno e laser, a alteração mais intensa desenvolvida foi de displasia severa, não havendo ainda células malignas, as quais acredita-se que seriam mais susceptíveis ao processo indutor proliferativo por apresentarem uma cascata de sinalização bastante alterada e autonomia para se multiplicar.
Talvez, devido a ação anti-inflamatória e reparadora do laser, ele tenha impedido a progressão da carcinogênese induzida pelo 4NQO, já que atuou em suas fases iniciais de inflamação e desintegração tecidual. É como se o carcinógeno tentasse alterar o tecido, mas o laser com suas propriedades terapêuticas não permitisse que esse evento fosse desencadeado. Por isso, a alteração tecidual mais severa do grupo que recebeu carcinógeno e laser foi a displasia moderada e severa, enquanto que no grupo A houve a formação de de 2 carcinomas in situ e 1 carcinoma superficialmente invasivo.
Vale salientar que apesar de todas as amostras teciduais submetidas à carcinogênese, incluindo os grupos D, E e F (com laser) terem apresentado infiltrado inflamatório crônico, este foi muito mais discreto nas amostras que
receberam a irradiação laser associada a indução carcinogênica. Isso pode ser explicado pela ação anti-inflamatória do laser de baixa intensidade, reduzindo edema, hiperemia e normalizando a circulação2.
Além dos achados de displasia, outros aspectos histopatológicos puderam ser observados durante a realização deste estudo. Dentre esses achados ocasionais, se destacou o aumento de células de aspecto claro, que possivelmente representam melanócitos, independente se o grupo recebeu ou não a laserterapia, De acordo com Katchburian, Arana (2004)34 o epitélio que recobre as papilas filiformes possui numerosos melanócitos, numa proporção de 1 melanócito para 5 queratinócitos. Nas amostras induzidas a carcinogênese a relação de melanócitos e queratinócitos está alterada. Haveria assim a necessidade de confirmação imunoistoquímica para os anticorpos (S100, HMB45 ou Melano A) para detectar se são melanócitos ou se é uma degeneração hidrópica induzida pelo infiltrado inflamatório. Independente disso sabe-se que esse achado histológico não é normal quando comparado ao grupo controle que possui um número bem inferior de células claras e é possível que essas características façam parte das alterações epiteliais displásicas do modelo animal utilizado.
A acantólise das células localizadas nas papilas epiteliais também foi observada em alguns animais dos grupos experimentais, fato esperado para as alterações displásicas, já que as células adquirem uma maior motilidade e tendência à migração. Em poucos casos, dentre os que receberam o 4NQO por 3 ou 4 meses, a acantólise exibiu tendência à formação de fendas semelhantes ao pênfigo vulgar. Este padrão pode representar um processo de acantólise
bastante acentuado com resposta autoimune ativada pelo carcinógeno químico, porém mais estudos são necessários para comprovar este achado.
O laser, independente do comprimento de onda utilizado, não aumentou a severidade das alterações epiteliais durante a carcinogênese oral experimental. Pelo contrário, houve sinais de amenização das alterações morfológicas provocadas pelo carcinógeno químico, colaborando para o desenvolvimento de lesões displásicas mais brandas.
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a
b c
d e
Figura 1 – Aspecto macroscópico de línguas de ratos Wistar. a. Aspecto clínico de normalidade da língua em animal do grupo controle. b. Lesão leucoplásica multifocal localizada em terço anterior e posterior da língua de animal do grupo A3.
c. Lesão eritroleucoplásia no terço anterior da língua de animal do grupo A3. d. Lesão leucoplásica no terço posterior da língua de animal do grupo E3. e. Lesão leucoplásica no terço médio e discreta eritroplasia no terço anterior da língua de animal do grupo E2.
Figura 2 - Fotomicrografia de corte histológico da língua.
a e b. Aspecto de normalidade do epitélio de revestimento da superfície dorsal e ventral da língua respectivamente em animal do grupo controle (H.E.- 200X).
c. Displasia leve em região de ventre de língua em animal do grupo A3 - 4NQO por 4 meses (H.E.- 400X).
d. Displasia leve em região de ventre de língua em animal do grupo experimental E3 - 4NQO + laser 780nm (H.E. – 200X).
e. Displasia moderada em região de ventre de língua em animal do grupo A3 - 4NQO 4 por meses (H.E.- 400X).
f. Displasia moderada em região de ventre de língua em animal do grupo D1 - 4NQO + laser 660nm (H.E.- 400X).
g. Displasia severa em região de dorso de língua em animal do grupo A3 - 4NQO por 4 meses (H.E.- 200X).
h. Displasia severa em região de ventre de língua em animal do grupo D2 - 4NQO + laser 660nm (H.E.- 400X).
Figura 3- Fotomicrografia das alterações histopatológicas adicionais.
a. Carcinoma in situ em dorso de língua de animal do grupo A3 - 4NQO por 4 meses (H.E.- 200X).
b. Carcinoma superficialmente invasivo em ventre de língua de animal do grupo A3. (H.E.- 400X).
c. Displasia leve exibindo intenso infiltrado inflamatório crônico em aspecto de reação liquenóide (animal do grupo A3) (H.E.- 200X).
d. Aumento do número de células claras da camada basal e parabasal (animal do grupo A1) (H.E.- 400X).
e. Formação de fendas intraepiteliais semelhante ao pênfigo vulgar (animal do grupo A3) (H.E.- 400X).
f. Displasia epitelial leve e metaplasia escamosa do ducto da glândula salivar menor em região de submucosa em animal do grupo E3 (H.E. 200X).
Anexo A