Linearidade ou modelo de calibração

A escolha de um modelo de calibração apropriado é necessária para uma adequada quantificação e, por isso, deve-se avaliar a relação entre a concentração do analito na amostra e a resposta analítica correspondente (130,133). A linearidade é entendida como a capacidade do método em fornecer respostas analíticas (variável dependente) diretamente proporcionais à concentração do analito (variável independente), numa determinada gama de concentrações, obtendo-se uma curva de calibração (129,134,140–142).

Os pontos de calibração ou calibradores utilizados para estabelecer essa relação devem ser preparados na matriz em estudo e as suas concentrações devem incluir toda a gama de calibração, sendo uniformemente distribuídas ao longo desta (124,129,130,133). A maioria das recomendações internacionais indicam que devem ser utilizados entre cinco a oito pontos de calibração (129,130,133). Outros autores sugerem que é mais vantajoso utilizar um menor número de pontos de calibração, embora com aplicação de mais replicados, já que facilita a deteção de pontos anómalos ou a necessidade de utilizar fatores de ponderação na calibração (130,142).

Foram preparadas quinze curvas de calibração, uma por analito, através da fortificação com os analitos em estudo de alíquotas (1 g) de uma pool de fígados brancos num total entre sete e nove calibradores distribuídos ao longo da gama de trabalho (tabela 10), não efetuando réplicas. A todos eles adicionou-se fentanil (PI) a 25 ng/g e aplicou-se o método analítico desenvolvido.

A curva de calibração que melhor se ajusta ao conjunto de resultados experimentais obteve-se por aplicação do método dos mínimos quadrados, subentendendo-se que as diferenças entre a concentração real e a nominal (resíduos) apresentam distribuição normal (valor nulo), sejam independentes e que se verifique homogeneidade de variâncias ao longo da gama de trabalho (homocedasticidade) (124,143).

Quanto aos critérios de aceitação das curvas de calibração definiu-se que o valor do r e do R2 tem que ser superior a 0,99; que a observação visual da distribuição dos resíduos ao longo dos valores de concentração não deve revelar tendências; que na interceção da curva de calibração com o eixo das ordenadas, o valor zero deve estar incluído num intervalo de confiança de 95% e que se devem excluir os dados cujos valores residuais sejam superiores ao dobro do erro-padrão (Sy/x) da curva de calibração (valores aberrantes)

(134,140).

No entanto, as estimativas obtidas na regressão e a representação gráfica da função não são suficientes para estabelecer a linearidade (124). Por isto, aplicou-se o teste de Mandel, com o qual se avaliou qual dos modelos – linear ou não linear – proporcionava o melhor ajuste dos pontos da curva de calibração (124,135,144). Sendo assim, foi necessário determinar a diferença entre a variância da correlação linear e a variância da correlação quadrática – equação 3 (124).

Equação 3:

Onde,

N representa o número de pontos de calibração; representa a variância da correlação linear;

representa a variância da correlação não linear (quadrática).

Calculou-se o valor de teste (Fcal), de acordo com a equação 4, e comparou-se com

o valor tabelado (Fcrit) da distribuição F de Snedecor (N-1;N-1;α) (124).

Equação 4:

 se Fcal ≤ Fcrit as diferenças entre as variâncias não são estatisticamente significativas

e consequentemente a função de calibração é linear;

 se Fcal > Fcrit as diferenças entre as variâncias são estatisticamente significativas e

consequentemente a função de calibração não é linear.

10.4.1 Gama de trabalho

A gama de trabalho corresponde à definição do intervalo entre o valor de concentração mínimo e máximo esperadas para o analito em estudo, de modo a evitar extrapolações (134). Estudada em simultâneo com a linearidade, a avaliação da gama de trabalho foi realizada para um modelo de calibração linear.

Assim, selecionaram-se, adicionalmente, duas concentrações representativas dos extremos, mínimo e máximo, do intervalo de concentrações selecionados para o estudo da linearidade. Foram analisadas cinco alíquotas (1 g) de fígado branco para cada uma dessas concentrações, às quais foi adicionado PI (25 ng/g). Estas alíquotas foram analisadas em conjunto com as amostras de calibração efetuadas para o estudo da linearidade de acordo com o método desenvolvido.

A existência de diferenças estatisticamente significativas entre os valores das variâncias nos limites da gama de trabalho foi verificada recorrendo ao teste de homogeneidade de variâncias (124,144). Para isso, calculou-se, segundo a equação 5, as variâncias associadas ao primeiro e ao último calibrador, , respetivamente (124,143,144). Equação 5:

i representa o ponto de calibração (i=1,2,…)

j representa o número de réplicas efetuadas para cada amostra de calibração; n representa o número de resultados obtidos;

yi representa o resultado obtido;

Tabela 10. Gama de trabalho e calibradores utilizados para cada um dos analitos em estudo.

Analito Gama de trabalho Nº

calibradores Amitriptilina 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 ng/g 8 Ciamemazina 9, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 480, 600 ng/g 9 Citalopram 15, 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 ng/g 9 Clomipramina 15, 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 ng/g 9 Clozapina 9, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 480, 600 ng/g 9 Fluoxetina 90, 150, 300, 600, 1200, 2400, 3600, 4800, 6000 ng/g 9 Haloperidol 36, 60, 120, 240, 480, 960, 1440, 1920, 2400 ng/g 9 Levomepromazina 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 ng/g 8 Mirtazapina 36, 60, 120, 240, 480, 960, 1440, 1920, 2400 ng/g 9 Sertralina 36, 60, 120, 240, 480, 960, 1440, 1920, 2400 ng/g 9 Tiapride 180, 300, 600, 1200, 2400, 4800, 7200, 9600, 12000 ng/g 9 Ticlopidina 36, 60, 120, 240, 480, 960, 1440, 1920, 2400 ng/g 9 Tramadol 15, 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 ng/g 9 Trazodona 30, 60, 120, 240, 360, 480, 600 ng/g 7 Venlafaxina 36, 60, 120, 240, 480, 960, 1440, 1920, 2400 ng/g 9

Já as equações 6 e 7 permitiram o cálculo do valor teste (PG) (124,144).

Equação 6: , se >

Equação 7: , se <

Para cada analito em estudo, o valor de PG foi comparado com o valor tabelado da distribuição F de Snedecor (Fcrit) para (N-1;N-1) graus de liberdade e para um nível de

confiança de 95% (α = 0,05), sendo estabelecido como critério de decisão que quando PG ≤ Fcrit as diferenças de variância não são consideradas estatisticamente significativas e a

gama de trabalho está bem ajustada, já quando se verifica o contrário as diferenças entres as variâncias são estatisticamente significativas e, por sua vez, a gama de trabalho não está bem ajustada (124,143,144).

10.4.2 Regressão linear ponderada

No estudo da linearidade assume-se a homogeneidade das variâncias, isto é, o desvio-padrão do erro para a variável dependente é constante ao longo da gama de

trabalho. Contudo, nem sempre se verifica esta premissa, havendo uma heterocedasticidade das variâncias. Nestes casos recorre-se ao método dos mínimos quadrados ponderados para harmonizar as discrepâncias entre as variâncias dos diferentes pontos de calibração (145).

Utiliza-se então a regressão linear ponderada (do inglês, weighted least squares

linear regression ou WLSLR), em detrimento da regressão linear simples (RLS). No

método dos mínimos quadrados ponderados recorre-se à minimização dos resíduos após ponderação, a qual é representada pela equação 8 (143,145).

Equação 8:

Onde,

representa a variância de Y.

Assim, para harmonizar as discrepâncias entre as variâncias dos diferentes pontos de calibração recorreu-se ao estudo de fatores de ponderação empíricos, como aproximação simplista da variância, baseados na variável independente (x) ou dependente (y):

(135,143,145).

A escolha do fator de ponderação empírico mais adequado foi baseada na determinação do erro relativo percentual (ER%) – equação 9, no cálculo do somatório do erro relativo percentual ( ) e na representação gráfica do ER% em função da concentração, sendo que neste último caso, os valores de ER% devem estar distribuídos de uma forma aleatória e dispostos paralelamente (sob a forma de faixa horizontal) em função da concentração. O fator de ponderação mais adequado foi aquele que originou a faixa horizontal mais estreita e o menor valor de (143).

Equação 9:

Onde,

Cest representa a concentração estimada na amostra;

Para este estudo prepararam-se quinze curvas de calibração, uma por analito, por fortificação de alíquotas (1 g) de uma pool de fígados brancos. Os pontos de calibração encontram-se distribuídos ao longo da gama de trabalho. A cada um destes foi adicionado o PI a 25 ng/g e procedeu-se à execução da metodologia desenvolvida. Este procedimento foi repetido durante cinco dias (num total de 75 curvas de calibração).