Linearidade, sensibilidade e faixa linear

A linearidade dos métodos foi avaliada em experimentos com curvas de calibração dos analitos, conforme procedimento descrito por Souza & Junqueira (2005). Após a definição da faixa de interesse, soluções dos analitos foram preparadas em sete níveis de concentração, sendo 50, 200, 350, 500, 650, 800 e 950 pg/µL de nonano, correspondentes a 0,25; 1,00; 1,75; 2,50; 3,25; 4,00 e 4,75 µg/kg de café. Foram preparadas três replicatas verdadeiras e independentes de cada nível, sendo as leituras feitas em ordem aleatória. Os brancos de solvente foram preparados, em triplicata, para todas as curvas como ferramenta de controle de qualidade interno e verificação do zero do equipamento. Em todas as soluções, foi adicionado padrão interno e padrão de seringa, visando manter as condições utilizadas na quantificação das amostras.

Os parâmetros da regressão foram estimados pelo método dos mínimos quadrados ordinários (MMQO), sendo a razão entre as áreas do analito e padrão interno correspondente à variável dependente yi e a razão entre a concentração do

analito e a concentração do padrão interno correspondente à variável independente xi.

Gráficos dos resíduos da regressão foram avaliados em relação a perfis óbvios que demonstrassem heterocedasticidade ou desvio de linearidade, sendo indicados como outliers os pontos fora do intervalo t_{(1 / 2;n 2)}s_res, sendo s_res o desvio padrão dos

resíduos da regressão. Em seguida, os outliers foram diagnosticados pelo teste de resíduos padronizados Jacknife, o qual foi aplicado sucessivamente até que novos outliers não fossem detectados ou até uma exclusão máxima de 22,2 % no número original de resultados. As premissas de normalidade (teste de Ryan & Joiner), homocedasticidade (teste de Brown & Forsythe), independência dos resíduos da regressão (teste de Durbin & Watson) foram verificadas, bem como a significância da regressão e adequação do ajuste ao modelo linear (ANOVA) (SOUZA & JUNQUEIRA, 2005).

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4.8.2 Efeitos de matriz e seletividade

Para avaliação dos efeitos de matriz foi empregado o método de adição de padrão. Duas curvas de calibração foram preparadas, com mesmas concentrações dos analitos, sendo 50, 200, 350, 500, 650 e 800 pg/µL de nonano, sendo uma curva preparada com o solvente (curva usual) e a outra em extratos de amostras de café torrado (curva matrizada). As curvas foram avaliadas como descrito para o estudo da linearidade. As inclinações foram comparadas pelo teste t com as variâncias combinadas ou distintas, após verificação da premissa de homogeneidade das variâncias dos resíduos das curvas pelo teste de F. As interseções não foram comparadas visto que as amostras utilizadas para elaboração da curva matrizada não eram brancas (THOMPSON, ELLISON & WOOD, 2002; SOUZA, 2007; BRASIL, 2011).

Um experimento complementar de seletividade foi realizado, empregando solução de uso do padrão nativo dos HPAs prioritários para a União Europeia, visando avaliar a capacidade de separação dos compostos presentes neste padrão, não contemplados no escopo do presente trabalho, pelo perfil dos cromatogramas e íons monitorados.

Para determinação da seletividade, após o estudo de recuperação e precisão, foi realizada também uma avaliação da variação entre as intensidades relativas dos íons obtidas para padrões e amostras, conforme critérios estabelecidos na Tabela 6 (EC, 2002a). Desta forma, espectros obtidos para soluções das curvas de calibração e para amostras adicionadas foram selecionados, aleatoriamente, para estimativa das intensidades relativas e respectivas variações.

Tabela 6. Variações máximas permitidas para as intensidades relativas de íons com diversas técnicas de espectrometria de massas

Intensidade relativa (% do pico base)

Variações máximas (%)

IE-CG-EM IQ-CG-EM, CG-EM_CL-EMn n, CL-EM,

>50 10 20

>20-50 15 25

>10-20 20 30

10 50 50

Fonte: EC (2002a).

IQ: ionização química; CG: cromatografia gasosa; LC: cromatografia líquida; EM: espectrometria de massas; EMn_{: espectrometria}

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4.8.3 Recuperação e precisão

Devido à inexistência de material de referência certificado (MRC) disponível para HPAs em café, a veracidade não pôde ser avaliada no presente trabalho. Recuperação e precisão, sob condições de repetibilidade e de precisão intermediária (reprodutibilidade parcial), foram investigadas em experimentos com amostras adicionadas de solução padrão dos analitos, em três níveis de concentração, na faixa linear. Os níveis de adição escolhidos foram 0,25; 1,00 e 3,00 µg/kg. A amostra sem adição também foi avaliada para estimativa da concentração nativa dos HPAs. Para cada nível de concentração estudado, incluindo a amostra sem adição, dezoito replicatas verdadeiras e independentes foram preparadas e analisadas. As replicatas foram divididas em três baterias analíticas com seis replicatas de cada nível de concentração. As bateriais analíticas foram realizadas em diferentes dias, por diferentes analistas, com variação de equipamentos e marcas/lotes de reagentes, quando possível, simulando condições de precisão intermediária (EC, 2002a; THOMPSON, ELLISON & WOOD, 2002; EC, 2007; SOUZA, 2007).

As recuperações foram estimadas, considerando a concentração total dos analitos nas amostras, ou seja, a média estimada para a concentração nativa somada à concentração adicionada. Outliers foram investigados dentre os valores de porcentagem de recuperação, de cada nível de concentração, pelo teste de Grubbs. Após remoção do valor, o teste de Grubbs foi aplicado, sucessivamente, até que novos outliers não fossem detectados ou até uma exclusão máxima de 22,2 % no número original de dados (SOUZA, 2007). Foram considerados aceitáveis, valores médios de recuperação entre 50 a 120 % (UE, 2011b).

Os desvios padrão relativos, sob condições de repetibilidade (DPRr) e

reprodutibilidade parcial (DPRR), foram estimados por análise de variância dos

resultados de porcentagem de recuperação, em cada nível de concentração. Para realização da análise de variância, as premissas relacionadas aos teste de F foram previamente testadas: normalidade (teste de Ryan & Joiner) e homoscedasticidade (teste de Brown & Forsythe) dos resíduos da recuperação (SOUZA, 2007). Para avaliação da precisão foram considerados os critérios estabelecidos pela UE (2011b).

O uso da técnica de diluição isotópica, com a adição de padrões internos no início da extração e do padrão de seringa, ao final desta, permitiu a avaliação da recuperação do método baseada no padrão interno. Esse parâmetro foi utilizado como uma ferramenta de controle de qualidade do método, avaliando a eficiência da extração individualmente para cada amostra e analito. Assim, as recuperações das amostras

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adicionadas foram corrigidas pelas respectivas recuperações de padrão interno. Para esta última, o mesmo critério de aceitabilidade (50 a 120 %) foi adotado (UE, 2011b).