5.1 Linha celular Caco-2
A linha celular Caco-2 desenvolvida pelo Instituto para Investigação do Cancro Sloan-Kettering é constituída por células heterogéneas humanas epiteliais do adenocarcinoma. Esta linha foi o resultado de uma investigação realizada por Dr. Jorgen Fogh e simula, de forma quase perfeita, os enterócitos do intestino delgado expressando vários transportadores envolvidos na absorção e excreção de fármacos, incluindo a P-gp (Fogh 1975, Silva, Carmo et al. 2013). Esta linha celular é muito utilizada na indústria farmacêutica como modelo in vitro das células da mucosa do intestino delgado, para prever a absorção de compostos administrados oralmente (Silva, Carmo et al. 2013). A versatilidade das células Caco-2 está demonstrada pelo facto de, até à data, servirem como base para a criação de modelos inovadores que contribuem para se entender o efluxo de compostos por vários transportadores entre eles a P-gp e a BCRP. O nível de expressão da P-gp nas células Caco-2 está em grande concordância com os níveis de expressão nos enterócitos do jejuno humano tendo sido descrito que este transportador localiza-se na membrana apical desta linha celular intestinal (Silva, Carmo et al. 2013).
92 Estas células Caco-2 expressam a P-gp e outros transportadores ABC em concentrações semelhantes ao das células intestinais com exceção do transportador BCRP (Silva, Carmo et al. 2011).
Apesar desta linha celular derivar do carcinoma do cólon/jejuno (intestino grosso), quando cultivadas sobre condições específicas, as células diferenciam-se formando uma monocamada de células epiteliais polarizadas de tal modo que o seu fenótipo, morfológico e funcional, se assemelha com os enterócitos que revestem o intestino delgado, proporcionando uma barreira física e bioquímica à passagem de iões e de pequenas moléculas (Moise Pinto 1983, Hidalgo, Raub et al. 1989, Artursson 1990).
As células Caco-2 reconstituem uma morfologia cilíndrica polarizada apresentando microvilosidades no lado apical, junções estreitas entre células adjacentes, atividade enzimática das hidrolases e um número de enzimas e transportadores que são características dos enterócitos, como por exemplo as peptidases, esterases, P-gp, sucrase-isomaltase, lactase, aminopeptidase-N, dipeptidilpeptidade IV (Sambuy, De Angelis et al. 2005). Apesar da expressão destas enzimas ser observada no cólon humano por volta das 15 semanas de gestação não estão presentes no cólon de indivíduos adultos (Sambuy, De Angelis et al. 2005). Ao mesmo tempo, possuem capacidade absortiva de sais biliares, cobalamina, glucose e dipéptidos, características comuns do intestino humano (Hunter, Jepson et al. 1993).
Entre outras características que são expressas nas células Caco-2 encontram-se os recetores de membrana polarizada para fatores de crescimento e várias atividades de transporte em ambas as membranas. Para melhor reproduzir as condições intestinais, as células Caco-2 são cultivadas em filtros permeáveis que permitem o acesso livre de iões e nutrientes aos dois lados da monocamada (Sambuy, De Angelis et al. 2005).
Estas células Caco-2 oferecem vantagens consideráveis comparando com as amostras in vivo ou in vitro do intestino, para o estudo das propriedades funcionais do processo de transporte, incluindo aquelas mediadas pela P-gp. As vantagens das células Caco-2 em relação a outros modelos reside no facto de serem constituídas por uma só camada epitelial, sem camada mucosa adjacente e sem tecidos musculares, impedindo assim que se liguem a solutos ou bloqueiem o acesso a superfícies membranares. Outra vantagem reside no facto de serem células de fácil manuseamento, com pouco risco associado de deteioração e facilidade de manutenção da viabilidade tecidual (Hunter, Jepson et al. 1993).
As células Caco-2 são normalmente utilizadas como uma monocamada confluente (Transwell).
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5.2 Linha celular RBE4
Modelos in vitro da BHE foram desenvolvidos a partir de culturas de bovinos, porcos, roedores, ou células endoteliais humanas dos microvasos cerebrais com roedores ou astrócitos humanos (Cecchelli, Dehouck et al. 1999, Gaillard, Voorwinden et al. 2001, Roux and Couraud 2005).
No entanto, estes modelos têm apresentado vários inconvenientes que limitam o uso destes modelos em investigação assim como em processos de screening de fármacos:
1. O uso destes modelos obriga ao dispêndio de muito tempo sendo ao mesmo tempo modelos muito caros;
2. As células endoteliais humanas dos microvasos cerebrais rapidamente se diferenciam in vitro, perdendo as características das células endoteliais da BHE após algumas passagens em cultura, limitando assim o seu uso para estudos bioquímicos e farmacológicos;
3. Em culturas primárias é difícil eliminar todas as células não endoteliais contaminantes (pericitos, células de musculo liso) (Roux and Couraud 2005). Estas células contaminantes ocupam espaço na monocamada, provocando muitas vezes o aparecimento de espaços vazios, pois as células endoteliais parecem ser incapazes de crescer sobre eles. Torna-se assim, uma limitação para estudos de permeabilidade transendotelial e transporte (Roux and Couraud 2005).
Como a maioria dos estudos são realizados em pequenos animais de laboratório, especialmente ratos, é importante estabelecer um sistema de cultura de células endoteliais do cérebro do rato (RBE) que permita a correlação entre os resultados in vitro e os resultados in vivo (Roux and Couraud 2005)
De modo a anular todos inconvenientes anteriormente referidos foram realizados vários estudos laboratoriais de modo a estabelecer uma linha celular de RBE que retenha um fenótipo estável em culturas que se assemelhe ao endotélio da BHE in vivo (Roux and Couraud 2005).
A primeira linha celular RBE a ser descrita foi a RBE4 por Roux em 1994 (Roux et al 1994), existindo mais linhas celulares de RBE que se encontram listadas na tabela (tabela 7) (Roux and Couraud 2005).
94 Tabela 7 – Linhas celulares imortalizadas de células endoteliais de capilares cerebrais de ratinhos. Adaptado
de (Roux and Couraud 2005).
Linha celular Gene imortalizado
RBE4 Adenovírus E1A
GP8/3.9 Antigénio – T SV40
GPNT Antigénio – T SV40
RBEC1 Antigénio – T SV40
TR-BBBs Antigénio – T SV40 Rbce4 Polyoma vírus large Antigen – T
Estas linhas celulares imortalizadas foram selecionadas baseadas numa série de critérios fenotípicos:
Exibição de fenótipo não transformado;
Expressão de certos marcadores de células endoteliais;
Expressão de determinadas propriedades específicas da BHE (Couraud, Greenwood et al. 2003).
A maioria destas linhas celulares da RBE foi imortalizada por transfecção. A linha celular RBE4 foi imortalizada por transfecção com o pE1A/neo plasmídeo usando o procedimento de coprecipitação de fosfato de cálcio, que basicamente consiste na ligação do plasmídeo ADN ao precipitado de fosfato de cálcio insolúvel que adere à superfície celular e o complexo entra depois na célula por endocitose (Grosjean, Bertschinger et al. 2006). Apesar desta técnica ser pouco eficaz é relativamente simples quando comparado com outros métodos de transfecção. O plasmídeo usado neste procedimento contém a região E1A do adenovírus 2 e o gene de resistência à neomicina
Como mencionado anteriormente as células RBE4 têm de ir ao encontro de alguns critérios de modo a ser considerado um modelo imortalizado in vitro da BHE.
Um dos parâmetros que a linha celular precisa de cumprir é a expressão de propriedades específicas da BHE que inclui junções estreitas, diferenciação citoesqueleto e estreitamento da monocamada, atividade enzimática da GGT e ALP e atividade dos transportadores membranares, incluindo a P-gp (Roux and Couraud 2005).
Esta linha celular é importante salientar que tem algumas discrepâncias quando comparado com a função in situ da BHE como baixos níveis de atividade enzimática ou de transportadores e alta permeabilidade paracelular, que deve ser tido em conta na realização de estudos usando este modelo (Roux and Couraud 2005).
95 A linha celular RBE4 tem sido utilizada para:
Demonstrar que a Molécula Intracelular de Adesão 1 (ICAM-1) no endotélio celular ativa várias vias de transdução de sinal;
Estudo das características de sinalização das células endoteliais cerebrais;
Regulação da P-gp;
Migração celular;
Estudos de permeabilidade (Krizbai, Szabo et al. 1995, Smith and Drewes 2006, Barakat, Turcotte et al. 2008)