LITERATURA CONSULTADA

2.1 Ciclo biológico da leishmaniose visceral

A Leishmania (Leishmania) donovani constitui o agente etiológico da LV na Índia, Paquistão, China Oriental, Bangladesh, Nepal, Sudão e Quênia; a L.

(L.) infantum na Região do Mediterrâneo e L. (L.) chagasi no Novo Mundo

(Guerin et al., 2002). As duas últimas espécies são consideradas coespecíficas, dentro do complexo L. donovani, segundo estudos utilizando técnicas bioquímicas e moleculares (Maurício et al., 1999).

No Brasil, a LV representa uma doença zoonótica sendo transmitida pela picada de fêmeas de dípteros da família Psychodidae, subfamília Phlebotominae e gênero Lutzomyia, cujo principal vetor é Lu. longipalpis. Entretanto, sabe-se que no ano de 1998 a Lu. cruzi foi identificada como um vetor na cidade de Corumbá, Mato Grosso do Sul, e evidências de transmissão da LV por essa mesma espécie foram descritas na cidade de Jaciara, Mato Grosso (Maia-Elkhoury et al., 2008). As fêmeas destes flebotomíneos, assim como outros dípteros hematófagos, possuem um caráter oportunista e por ocasião de seu repasto sanguíneo uma ampla variedade de vertebrados faz parte de sua alimentação no ambiente antrópico (Desjeux, 2002; Dias et al., 2003).

Na epidemiologia da LV, o cão (Canis lupus familiaris) constitui o principal reservatório doméstico do parasito, o que lhe confere potencial importância na manutenção da LV no ambiente domiciliar (Deane e Deane, 1962). No ambiente silvestre, os principais reservatórios são também canídeos, destacando-se as raposas Cerdocyon thous e Lycalopex vetulus (Shaw, 2003).

No Novo Mundo, gambás - Didelphis marsupialis (Corredor et al., 1989; Zulueta et al., 1999) e ratos – Rattus rattus (Zulueta et al., 1999) foram encontrados naturalmente infectados por L. chagasi, sendo também incriminados como reservatórios silvestres da LV. Portanto, a presença peridomiciliar de animais domésticos e sinantrópicos possui uma grande importância na manutenção da

Lu. longipalpis (Desjeux, 2002; Dias et al., 2003).

A L. chagasi é um parasito digenético e seu ciclo biológico se inicia no momento em que fêmeas de Lu. longipalpis realizam o repasto sanguíneo em um hospedeiro infectado. Nesse momento, pode ocorrer a ingestão de formas amastigotas do parasito, existentes nos vacúolos de células do sistema mononuclear fagocitário (SMF), principalmente macrófagos, na derme, juntamente com componentes do repasto sanguíneo. Uma vez no intestino médio do flebótomo, essas formas amastigotas se diferenciam nas chamadas promastigotas procíclicas que são móveis, capazes de se aderir ao epitélio do tubo digestivo e se multiplicar por divisão binária. Essas possuem uma camada de moléculas de glicoconjugados, lipofosfoglicanos (LPG), em sua superfície, consistindo de um núcleo glicana, uma âncora lipídica altamente conservada e unidades variáveis de oligossacárides. Interações envolvendo LPG com lectinas e moléculas tipo lectinas presentes no intestino do inseto impedem que as formas promastigotas procíclicas sejam eliminadas juntamente com o bolo alimentar. Extensa modificação estrutural, durante a metaciclogênese, envolvendo o tamanho e a expressão de açúcares de LPG, transformam essas formas em promastigotas metacíclicas. A expressão de grande quantidade de LPG, bem como de outros glicoconjugados, como a metaloprotease - gp63, na superfície do parasito é capaz de protegê-lo da ação das enzimas hidrolíticas

presentes no intestino do flebotomíneo (killick-kendrick, 1990; Alexander et al., 1999). As promastigotas metacíclicas apresentam reduzida afinidade de ligação às lectinas, levando ao desligamento do epitélio intestinal e migração para a probóscida do inseto. Em nova alimentação, as formas promastigotas metacíclica infectantes são depositadas na derme do próximo hospedeiro, junto à saliva do inseto, sendo internalizadas por macrófagos, processo esse, mediado por receptores (Cunningham, 2002; de Almeida, 2003). As promastigotas se diferenciam em formas amastigotas, nos fagolisossomas. Dentro das células do SMF, as amastigotas multiplicam-se por divisão binária, até rompimento da célula hospedeira, com posterior infecção de novas células. O flebotomíneo, ao realizar nova hematofagia, ingere os macrófagos infectados, perpetuando, assim, o ciclo biológico.

2.2 Leishmaniose visceral canina

2.2.1. Quadro clínico

Segundo Alvar et al. (2004) e Grima (2005), o período de incubação e a apresentação clínica da leishmaniose visceral canina (LVC) variam intensamente nos animais acometidos, partindo de total ausência até graves sinais clínicos. Na LVC, assim como em outras doenças parasitárias, fatores específicos dependentes do hospedeiro e do parasito determinam o desenvolvimento dos mecanismos patogênicos da doença, das lesões e, em última análise, dos sinais clínicos dos animais acometidos. Tais processos patogênicos têm como fator comum a presença do parasito e como fator de distinção as reações orgânicas, sejam elas de resposta imune ou não, de

efetividade e intensidade distintas (Ezquerra, 2001). Desta forma, após a inoculação de formas promastigotas na pele pelo inseto vetor, a resposta imune que ocorre no hospedeiro modula a apresentação clínica da afecção (Gama et al., 2004).

Pesquisas afirmam que a maior parte dos cães infectados pela L.

chagasi são susceptíveis e acabam por desenvolver a doença patente,

enquanto uma pequena porcentagem se mostra resistente compreendendo um grupo em que não há manifestação dos sinais ou, caso ocorra, há espontânea remissão destes. A apresentação mais evidente da doença nos cães é a leishmaniose viscero-cutânea, onde se observam alterações do tegumento, renais, hepáticas, esplênica e oculares (Nieto et al., 1992; García-Alonso et al., 1996).

O período inicial da infecção, geralmente cursa como uma síndrome geral inespecífica, que pode passar despercebida, sendo caracterizada por discreta perda de peso, apatia e ocasionalmente episódios de febre (Grima, 2005). Os sinais posteriores, mais evidentes, são lesões de pele, com alopecia e intensa descamação seca, não pruriginosa e usualmente aparecendo na cabeça e se estendendo por todo o corpo; onicogrifose; perda de peso progressiva muitas vezes acompanhada de anorexia; linfoadenopatia local ou generalizada; lesões oculares, como blefarite e ceratoconjuntivite bilaterais; epistaxe; anemia; falência renal, em consequência à deposição de imunocomplexos e diarréia, onde exames endoscópicos e espécimes para biópsia evidenciaram colite ulcerativa e inflamação granulomatosa da mucosa intestinal (Genaro, 1993; Ferrer, 1999; Grima, 2005).

Avaliando o quadro clínico-patológico de cães natural e experimentalmente infectados por L. infantum, Martínez-Moreno et al. (1995) observaram que os sinais clínicos encontrados no grupo experimentalmente infectado consistiam em perda de peso, apatia, discreta linfoadenopatia, alopecia na face e extremidades; ao passo que, no grupo naturalmente infectado além dos achados anteriores foram observados outros como astenia, lesões ulcerativas, onicogrifose, conjuntivite e rinite. Nos dois grupos, a

Leishmania foi isolada e identificada através de exames microscópicos de

fragmentos retirados do baço, linfonodos, fígado, rins, pele e sistema reprodutivo. Tendo como objetivo também o acompanhamento da evolução clínico-patológica da LVC, Nieto et al. (1999) avaliaram quatro cães infectados experimentalmente em um período de 343 dias. Os dados revelaram que aos 75 dias após a infecção formas amastigotas podiam ser observadas nos linfonodos poplíteos de todos os animais infectados, sendo que, o primeiro sintoma observado foi a linfoadenomegalia. Em um cão, a infecção se manifestou de forma latente com presença de dermatite e onicogrifose. Dois animais desenvolveram a forma patente ou sintomática da LVC, ou seja, perda de peso, adenopatia, onicogrifose e dermatite esfoliativa e ulcerativa na cauda, orelhas e extremidades. Inversamente, em um cão houve remissão dos sintomas aos 200 dias, com subseqüente citologia negativa de aspirado de linfonodo.

2.2.2 Resposta Imune

A resposta imune contra antígenos de natureza protéica, como as formas de Leishmania, é regulada, em grande parte, por células T CD4+ _ou linfócitos T auxiliares (Th) que têm a capacidade de produzir uma grande variedade de citocinas em resposta a estes antígenos (London et al., 1998).

Pesquisas anteriores demonstraram que clones de células T CD4+, em modelo murino, poderiam ser divididos em dois subtipos, fundamentados no perfil de citocinas secretadas em resposta a um antígeno. O subtipo de células T, denominado de Th-1, secretava interleucina (IL)-2, interferon (IFN)- , fator de necrose tumoral (TNF)-α e linfotoxina (LT); enquanto o subtipo Th-2 secretava IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13 (Mosmann et al., 1986; Fiorentino et al. 1989).

Segundo Abbas et al. (2002), o IFN- constitui a principal citocina do subtipo Th-1 que atua na ativação e incremento da atividade microbicida de macrófagos e estimula a produção de IgG fixadora de complemento. Além disso, as citocinas produzidas por esta população promovem a diferenciação de linfócitos T CD8+ em células citotóxicas e ativação de neutrófilos e células “natural killer”. Desta forma, as citocinas produzidas pela população Th-1 estimulam a fagocitose de microorganismos e eliminação de patógenos intracelulares (London et al. 1998).

Estudo realizado por Jaffe (1999), com o objetivo de se verificar o perfil da resposta imunológica na LV, observou no modelo murino que os animais apresentavam cura quando desenvolviam resposta predominantemente celular do tipo Th-1. Os fatores que determinam o desenvolvimento patente das

deficiente produção de IFN- , após a exposição ao antígeno Leishmania, é um fator relatado normalmente e está associado com incremento de células T CD4+ expressando um perfil de citocinas Th-2, com a produção de IL-4 e IL-10, mas não de IL-2 ou IL-12 (Gama, 2004).

Segundo Pinelli et al. (1994), em cães a infecção sintomática está associada com a crescente produção de anticorpos e imunorregulação negativa da resposta imune celular periférica, associada a decrescente produção de IL-2, IFN- e FNT-α com ineficiente eliminação do parasito. Desta forma, cães sensíveis a LV tendem a desenvolver resposta imune predominantemente humoral caracterizada por hipergamaglobulinemia policlonal, enquanto que, os resistentes apresentam expressiva resposta celular (Ferrer et al., 1995). Entretanto, até o momento, o exato papel das citocinas do subtipo Th-2, em cães portadores de LV, não está completamente definido. Enquanto há uma correlação positiva entre patologia e incremento da produção de IL-10 em humanos, o envolvimento desta citocina em cães portadores de LV ainda é controverso. Com o intuito de verificar o perfil tecidual de citocinas em cães naturalmente infectados com LV, Quinnell et al. (2001) mensuraram os níveis de RNAm para IFN- , IL-4, IL-10, IL-13 e IL-18 em aspirados de medula óssea. Os níveis de IFN- mostraram-se mais elevados nos cães com LV em comparação aos cães sadios. Observou-se, também, correlação positiva significativa entre a presença de RNA-m para IFN- e os níveis de IgG1 anti-Leishmania. Contrariamente, não houve correlação com os níveis de IgG2, IgG4 e resposta linfoproliferativa ao antígeno Leishmania.

As descrições das respostas celular e humoral, em cães experimentalmente infectados, foram feitas por Martinez-Moreno et al. (1995)

durante um período de 110 dias. A avaliação humoral foi realizada através de reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e ensaio imunoensimático (ELISA) e a responsividade das células T foi avaliada através da reação intradérmica (IDR) e ensaio linfoproliferativo in vitro. A resposta das células T ao antígeno de

Leishmania foi negativa tanto na IDR quanto no ensaio in vitro, conjuntamente

houve produção específica de anticorpos IgG anti-Leishmania. Esta ausência de resposta celular foi considerada específica uma vez que, no ensaio in vitro, quando submetida ao mitógeno concavalina-A houve linfoproliferação. Desta forma, as observações dos parâmetros imunológicos, nas primeiras semanas pós-infecção, sugerem que fatores responsáveis por esta resposta anérgica se manifestam muito rapidamente e que o desenvolvimento da doença nos cães está relacionado com a perda da imunidade celular específica e com uma considerável, mas inefetiva resposta do tipo humoral. Estes resultados coincidem com dados anteriores de Martinez-Moreno et al. (1993), que revelam ineficiente resposta imune mediada por células em cães portadores da forma sintomática de LV com presença precoce de anticorpos específicos anti-

Leishmania.

A LVC está associada tanto com a ativação policlonal das células B, por componentes antigênicos do parasito, quanto à efetiva resposta clonal específica com produção de imunoglobulinas (Ig) anti-Leishmania (Quinnell et al. 2003). Martinez-Moreno et al. (1993), em pesquisa avaliando a atividade de linfócitos T e B em cães infectados por LV, concluíram que a presença da

Leishmania leva a ativação dos linfócitos B com posterior transformação destes

em plasmócitos. A resposta humoral específica da LVC caracteriza-se pela produção de elevados níveis de IgG anti-Leishmania, permitindo ampla

utilização do diagnóstico sorológico (Canãvate et al., 2005). Assim sendo, técnicas sorológicas constituem importantes ferramentas no diagnóstico e estudo da doença, estando fundamentadas na detecção de anticorpos específicos anti-Leishmania (Gradoni, 2002).

2.2.3 Tratamento

No ano de 1912, coube a um cientista brasileiro, Gaspar Vianna, a vanguarda na utilização de um composto antimonial trivalente (SbIII_{), o tártaro} emético, para o tratamento da leishmaniose. A importância desta descoberta foi viabilizar o tratamento da LMC, com repercussões inclusive fora do Brasil (Vianna, 1912). Entretanto, em razão de seus graves efeitos colaterais, os complexos Sb trivalentes foram substituídos, a partir do ano de 1945, pelos antimoniais pentavalentes (SbV_{), os quais passaram a constituir as drogas de} primeira escolha para o tratamento das leishmanioses (Frezárd, 2001, Demicheli et al., 2002). Segundo os dois últimos autores, existem dois modelos propostos para os mecanismos de ação dos antimoniais pentavalentes. O primeiro seria que o Sbv se comportaria como uma pró-droga, sendo reduzido por tióis a SbIII _{, no organismo hospedeiro. Essa hipótese considera que o Sb}III seria a forma ativa e tóxica do antimônio. A biomolécula glutationa, que contém o grupamento sulfidrila e é o tiol predominante no meio intracelular, seria um forte candidato a agente redutor de SbV a SbIII. Tem sido sugerido que nos meios biológicos o SbIII interagiria com grupos sulfidrilas de certas proteínas, resultando em perda de sua função. A outra hipótese foi formulada a partir da demonstração em que o SbV forma complexos com ribonucleosídeos (SbV- ribonucleosídeo) e que essa interação poderia ter implicações no mecanismo de ação dos antimoniais.

Existem comercialmente duas formas de apresentação dos antimoniais pentavelentes: o antimoniato de N-metil-D-glucamina (Glucantime®_{, Rhodia),} na América Latina e África, e o estibogluconato de sódio (Pentostam®, Welcome), nos EUA e Europa (Lima et al., 2007). Dentre os fármacos de segunda escolha podemos citar: o isotiocianato de pentamidina, que consiste em uma diamidina que se une ao DNA do cinetoplasto do parasito, com o mecanismo de ação primário desconhecido; o desoxicolato sódico de anfotericina B (e formulações lipossomais), antibiótico polieno que interage com o ergosterol da membrana celular capaz de formar poros que alteram a permeabilidade celular e o balanço iônico, causando morte celular. Além disso, podemos citar os imunomoduladores como o interferon-gama (IFN-) e o fator

de crescimento de colônias de macrófagos e granulócitos (GM-CSF) (Ministério da Saúde, 2004).

Quando consideramos o tratamento da LVC, os fármacos comumente utilizados podem ser reunidos em dois grupos: os que apresentam ação direta sobre o parasito quer seja pela ação leishmanicida, quer seja como leishmaniostático (impedindo sua replicação), e os grupos capazes de modular o sistema imune como o levamizol, citocinas e vacinas (Ribeiro, 2007). Segundo Baneth (2002), as publicações referentes ao tratamento de animais com LVC avaliam a eficácia do protocolo terapêutico sob dois pontos principais: melhora dos sinais clínicos dos cães ou mudanças do padrão imunológico e sorológico. Outro importante aspecto parasitológico, entretanto abordado em menor escala, consiste na avaliação da capacidade infectante dos cães junto ao inseto vetor, quando da realização do xenodiagnóstico. Entretanto, as drogas anti-leishmanicidas usadas com sucesso na terapia em humanos têm

se mostrado de eficácia controversa no tratamento da LVC. Muitas das vezes, os fármacos induzem uma remissão temporária dos sinais clínicos, nem sempre previnem a ocorrência de recidivas e, frequentemente, causam vários efeitos colaterais. Adicionalmente, têm efeito limitado na infectividade de cães junto ao inseto vetor, levando ao risco de selecionar parasitos resistentes às drogas utilizadas (Baneth, 2002; Baneth e Shaw, 2002; Noli e Auxilia, 2005).

Devido ao risco de desenvolvimento de resistência do parasito aos antimoniais, no Brasil, em parecer nº 0299/2004 da Advocacia Geral da União, o Antimoniato de Meglumina (Glucantime®, Rhône Mérieux, Lyon, França) teve sua distribuição e uso restrito ao serviço público de saúde, destinado ao tratamento humano, não podendo ser utilizado em nenhuma condição para o tratamento de cães com LV. Em medida semelhante, no ano de 2008, o ministério da Saúde juntamente com o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento publicaram em Portaria Interministerial nº 1.426, Art. 1º, a proibição, em todo o território nacional, do tratamento de cães infectados com LV ou doentes com produtos de uso humano ou não registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Ministério da Saúde, 2009).

Considerando que a estratégia adotada no Brasil, com relação ao controle da LV, está fundamentalmente dirigida verticalmente no: 1) diagnóstico e tratamento precoce dos casos humanos; 2) aspersão de inseticidas de ação residual para combate do inseto vetor e 3) eutanásia de cães, após inquérito sorológico (Ministerio da Saúde, 2004), medida pouco aceita por questões éticas e sociais (Moreno e Alvar, 2002; Ribeiro et al., 2008), a utilização de fármacos carreados em lipossomas representam uma estratégia promissora, já que esse sistema carreador aumenta consideravelmente a eficácia dos

antimoniais contra a LVC em estudos prévios (Frezárd, 1999; Schettini, 2003; Costa Val, 2004; Schettini, 2005; Schettini, 2006; Moura, 2007; Ribeiro, 2007; Ribeiro et al., 2008). Somado a isso, existe uma literatura internacional que considera a associação de antimoniato de meglumina e alopurinol, uma das terapias mais eficazes no tratamento da LVC (Alvar et al., 1994; Denerolle e Bourdoiseau, 1999; Baneth e Shaw, 2002; Noli e Auxili, 2005; Torres et al., 2011).

3.0 JUSTIFICATIVA

A leishmaniose visceral (LV) constitui uma das chamadas doenças tropicais negligenciadas, estando no Brasil, incluída na categoria 3, segundo a Organização Pan Americana de Saúde/ Organização Mundial de saúde (OPAS/OMS), uma vez que, o campo da saúde pública não possui ferramentas efetivas para o controle avançado.

O Ministério da Saúde (MS), em conjunto com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) elaboraram e publicaram após o I Fórum de discussão sobre LV canina em Brasília/ DF, com a presença de expertos, a Portaria Interministerial nº 1.426, de 11 de julho de 2008, a qual: “... proíbe o tratamento da LVC com produtos de uso humano ou não registrado

no MAPA”.

Considerando essa medida, várias ações foram impetradas contra a União, juntamente com a Ação Civil Pública movida no Estado de Minas Gerais, onde foram apresentados pelos requerentes informações fundamentadas em pesquisas sobre avanços nos estudos da LVC. Com o objetivo de avaliar essas ações, outro Fórum de discussão (II Fórum) sobre tratamento da LVC foi realizado em Brasília/DF concluindo que:

“... a recomendação desse fórum é de que seja mantida a proibição do

tratamento da LVC pelos Ministérios da Saúde e da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, conforme a Portaria IM nº 1.426 (2008) que regulamenta o

A comunidade científica internacional tem apresentado algumas alternativas para o controle do vetor, assim como propostas de intervenção junto aos reservatórios domésticos como: uso de coleiras impregnadas por inseticidas a base de piretróides, tratamentos quimioterápicos e vacinas. Nesse contexto, um grupo de pesquisadores, pertencentes a diferentes unidades da UFMG, desde o ano de 1999, avaliam novos medicamentos e novas formulações para os medicamentos contra as leishmanioses, em diferentes modelos experimentais. Em conjunto, a linha de pesquisa de nosso laboratório está fundamentada no estudo da interação Leishmania-macrófagos peritoneais caninos, in vitro, assim como avaliação da expressão desses receptores da família das 2-integrinas em monócitos, macrófagos peritoneais e teciduais. Desta forma, torna-se importante avaliar o impacto do tratamento utilizando formulação de antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas nanométricos associação ao alopurinol, na expressão de receptores de superfície de monócitos em cães naturalmente infectados com

Leishmania (Leishmania) chagasi, bem como a frequência de linfócitos TCD4 e

TCD8 no sangue periférico, somado às avaliações clinica e histopatológica. Portanto, a proposta do atual trabalho se justifica, pois além do cão ser bom modelo de estudo da doença LV, o conhecimento da resposta clínica, imunológica e histopatológica desses, após o tratamento quimioterápico, é relevante.