A hibridização in situ de BbrizGID1, BbrizIPT9 e BbrizLOG foi realizada nos estádios iniciais do desenvolvimento do ovário de plantas sexuais e apomíticas de B. brizantha, para entender a localização celular da expressão destes genes nos eventos iniciais do desenvolvimento do óvulo e inferir sobre sua relação com os principais eventos de diferenciação do SE.
Os transcritos de BbrizGID1 nos estádios iniciais do desenvolvimento do SE de plantas apomíticas e sexuais foram observados (Figura 21). As secções coradas com laranja acridina mostraram a presença de RNA preservado em nucléolos e citoplasma das células dos ovários de plantas sexuais (Figura 21A) e apomíticas. A sonda antisenso de BbrizGID1 nos estádios iniciais da megasporogênese resultou em forte sinal de hibridização na CMM de plantas sexuais (Figuras 21B e 21C) e apomíticas (Figuras 21E, 21F e 21G). As células nucelares, no início da megasporogênese, de ovários sexuais apresentaram sinal fraco de hibridização (Figuras 21B e 21C) em comparação com a forte marcação nas células nucelares de apomíticos (Figuras 21F e 21G). Foi interessante observar uma forte expressão de
BbrizGID1 nas células nucelares, apenas na região onde as iniciais apospóricas aparecem,
diferente do que foi observado no ovário sexual, em que a expressão foi detectada apenas nas CMMs. Os tegumentos interno e externo tanto nas plantas sexuais quanto nas apomíticas mostraram fraco sinal de hibridização (Figuras 21C e 21F). As anteras apresentaram forte
sinal de hibridização na célula mãe do micrósporo e não foi detectado sinal no tapetum de plantas sexuais e apomíticas (Figuras 21B e 21E). A sonda controle senso não apresentou sinal de hibridização nos ovários sexuais e apomíticos (Figuras 21D e 21H).
Figura 21. Localização da expressão de BbrizGID1 por hibridização in situ em secções semi-
finas de ovários e anteras de plantas sexuais (A – D) e apomíticas (E – H) de Brachiaria
brizantha. A - Ovário mostrando preservação do RNA total (laranja), seta indicando a CMM
em controle com laranja de acridina. B - Visão geral do ovário apresentando forte sinal de hibridização na CMM (seta) e anteras mostrando forte sinal de hibridização nas células mãe do micrósporo (cabeça de seta). C - Detalhe do óvulo com forte marcação na CMM (seta) e apresentando sinal mais fraco nas células nucelares (nu), e nos tegumentos interno (ti) e externo (te). D - Controle hibridizado com a sonda senso sem sinal. E - Visão geral do ovário de plantas apomíticas apresentando forte marcação na CMM (seta) e anteras com forte sinal de hibridização nas células mãe do micrósporo (cabeça de seta). F - Detalhe do óvulo com forte sinal de hibridização na CMM (seta) e nas células nucelares (nu), e apresentando sinal fraco nos tegumentos interno (ti) e externo (te). G - Secção seguinte do óvulo anterior (F) mostrando o citoplasma da CMM fortemente hibridizado (seta). H - Ovário hibridizado com a sonda senso (controle) e não apresentando sinal. CMM = célula mãe do megásporo; Barras: A = 10 μm, B = 50 μm, C = 12 μm, D = 20 μm, E = 100 μm e F – H = 10 μm.
A localização dos transcritos de BbrizIPT9 foi observada nos estádios iniciais do desenvolvimento do óvulo, início da megasporogênese, de plantas sexuais e apomíticas (Figura 22). Foi verificado fraco sinal na célula arqueospórica, que posteriormente irá se diferenciar em CMM e forte sinal de hibridização foi detectado na porção superior do estilete de plantas apomíticas (Figura 22A), na CMM também foi detectado forte sinal de expressão quando comparado com as células nucelares (Figura 22B). A sonda controle senso não apresentou sinal de hibridização nos ovários de plantas apomíticas (Figura 22C) e sexuais.
Durante a megasporogênese de plantas sexuais, foi evidenciada forte hibridização na CMM e nas células nucelares próximas (Figura 22E e 22F). Em relação aos tegumentos não foi observado sinal de hibridização em ovários de plantas apomíticas e nem de plantas sexuais (Figura 22F). Nos ovários de plantas sexuais foi detectado forte hibridização nas lodículas (Figura 22G). Anteras de plantas sexuais e apomíticas apresentaram sinal de hibridização na célula mãe do micrósporo (Figuras 22D e 22H).
Transcritos de BbrizLOG foram detectados nos estádios de megasporogênese e megagametogênese durante o desenvolvimento do óvulo de plantas sexuais e apomíticas (Figura 23). A sonda controle senso não apresentou sinal de hibridização nos ovários de plantas apomíticas e sexuais (Figuras 23A e 23D). No estádio de megasporogênese em plantas apomíticas, foi observado sinal de hibridização na CMM, forte marcação na célula inicial apósporica e fraco sinal de hibridização nas células nucelares e tegumentos (Figuras 23B e 23C). Nos ovários de plantas sexuais foi observada forte expressão na CMM e também sinal de hibridização nas células nucelares próximas à CMM (Figuras 23E e 23F). Nos tegumentos interno e externo tanto nas plantas sexuais quanto nas apomíticas não houve sinal de hibridização. Em estádios posteriores de desenvolvimento dos ovários de plantas apomíticas foi observada forte expressão nas células nucelares e nas células do aparato da oosfera. Em plantas sexuais, no estádio de megagametogênese, foi observado sinal de hibridização nas células nucelares e no citoplasma de todas as células do aparato da oosfera (Figura 23G), e não foi observado sinal de hibridização nas antípodas (Figura 23H). Nas anteras de plantas apomíticas (Figura 23I) e sexuais houve forte sinal de hibridização nos micrósporos.
Figura 22. Localização da expressão de BbrizIPT9 por hibridização in situ em ovários e
anteras de plantas apomíticas (A – D) e sexuais (E – H) de Brachiaria brizantha. A - Ovário mostrando pouca marcação na célula arqueospórica (seta fina) e forte hibridização na porção superior do estilete (seta larga). B - Detalhe do ovário apresentando sinal de hibridização na CMM (seta). C - Ovário hibridizado com a sonda controle senso. D - Antera com hibridização nas células mãe do micrósporo (setas). E - Ovário de planta sexual com forte sinal de hibridização na CMM e nas células nucelares próximas (seta). F - Detalhe do óvulo apresentando forte marcação na CMM (seta) e com pouco sinal de hibridização nos tegumentos (te). G - Lodículas de planta sexual com forte hibridização (setas). H - Antera de planta sexual com hibridização nas células mãe do micrósporo (setas). CMM = célula mãe do megásporo. Barras: A – B = 10 µm; C – D = 20 µm; E – F= 10 µm ; G – H = 25 µm.
Figura 23. Hibridização in situ de BbrizLOG em ovários e anteras de plantas apomíticas (A – C, I) e sexuais (D – H) de Brachiaria brizantha nos estádios de megasporogênese e
megagametogênese. A - Ovário hibridizado com a sonda controle senso sem sinal, seta indicando a CMM. B – C Ovários apresentando sinal de hibridização na CMM (seta larga) e forte expressão na célula inicial apósporica (seta fina). D - Ovário de planta sexual hibridizado com a sonda controle senso, seta mostrando a CMM. E - Ovário evidenciando forte expressão no citoplasma da CMM (seta larga). F - Detalhe do óvulo mostrando o núcleo da CMM fortemente hibridizado (seta fina) e células nucelares (seta larga). G - Saco embrionário maduro (seta) de planta sexual mostrando hibridização nas células do aparato da oosfera. H - Detalhe das antípodas (seta) em que não houve sinal de hibridização. I - Anteras de plantas apomíticas com forte sinal de hibridização nos micrósporos (setas). CMM = célula mãe do megásporo; Barras: A = 5 µm; B – C = 2 µm; D – F = 25 µm; E, G – I = 10 µm.
4.5 Determinação da localização de expressão de GID1 em plantas de A. thaliana e