O ANF foi realizado em 77 pacientes, sem nenhuma complicação. Considerando os 71 pacientes incluídos no estudo, em um caso do grupo de SR não houve quantidade de amostra suficiente para a dosagem de IL-10 e em cinco amostras não foi possível realizar o exame de citologia diferencial. Portanto, a colheita e processamento da amostra para realização de dosagem de IL-10 foram realizados com sucesso em 70/71 (99%) casos. As amostras demonstraram uma adequada qualidade para realização de exame citológico diferencial em 66/71 (93%) casos. Cada amostra coletada com sucesso permitiu a obtenção de uma média de quatro alíquotas de 100 µl de sobrenadante, quantidade suficiente para mensuração de pelo menos quatro marcadores inflamatórios pelo método de ELISA. A média da viabilidade celular das amostras foi superior a 90% nos três grupos.
6 Discussão
No presente estudo, a concentração de IL-10 mostrou-se significativamente aumentada na secreção nasofaríngea de lactentes com primeiro episódio de sibilância, quando comparada com a de lactentes com IVAS. Foi encontrado também um predomínio absoluto de neutrófilos em secreção nasofaríngea nos três grupos (primeiro episódio de sibilância, SR e IVAS). Além disto, não foram encontrados eosinófilos nestas amostras, exceto em um paciente com sibilância recorrente. Mesmo assim, tal paciente apresentava somente 1% de eosinófilos no ANF.
O motivo pelo qual somente alguns lactentes apresentam sibilância secundária a infecções respiratórias virais ainda permanece obscuro. As principais hipóteses suscitadas pela literatura são: via aérea de menor calibre, alterações da resposta imune e/ou do controle neural (STEIN & MARTINEZ, 1999; FOLKERTS et al., 1998). Suas respectivas importâncias ainda não têm clara comprovação científica. Algumas dessas hipóteses já foram bem estudadas e outras ainda se encontram em fase de investigação. Esses mecanismos não são excludentes em um mesmo paciente, podendo estar associados.
A possibilidade de alguns indivíduos nascerem com uma alteração da resposta imune, que possa exacerbar uma resposta inflamatória a infecções respiratórias virais, ainda permanece no terreno especulativo. Contudo, BLANCO-QUIRÓS et al. (1999) demonstraram que crianças que desenvolveram BVA apresentavam baixos níveis de IL-12 (citocina com potente efeito Th1) ao nascimento e altos níveis de IL-12 e IL-10, no sangue, durante o episódio agudo de sibilância. Além disto, parece haver uma associação de determinados polimorfismos de IL-10 com doença respiratória.
Polimorfismos que se caracterizam por diminuída ou elevada produção de IL-10 parecem estar associados com asma grave no adulto ou sibilância recorrente na criança de origem não atópica, respectivamente (LIM et al., 1998; BALDINI & MARTINEZ, 2001). Além disto, JOHN et al. (1998) demonstraram que macrófagos alveolares de pacientes com asma produzem menos IL-10, quando comparados aos de pacientes voluntários não asmáticos. No presente estudo, lactentes com sibilância (primeiro episódio) produziram mais IL-10 no ANF do que pacientes com IVAS (sem doença de vias aéreas inferiores). Com esses achados, pode-se admitir a hipótese de que alguns lactentes sejam portadores de uma “predisposição genética” para uma exacerbada e específica resposta inflamatória a infecções respiratórias virais, predispondo à DOB não associada a atopia, nesta faixa etária.
A predominância de neutrófilos na secreção nasofaríngea, nos três grupos analisados, detectada neste estudo, sugere que esta célula deve desempenhar um papel importante nas infecções respiratórias virais. Este achado assemelha-se aos resultados já descritos em outros estudos (EVERARD et al., 1994; SHEERAN et al., 1999). Não houve diferença estatisticamente significativa no exame citológico diferencial do ANF, quanto ao tipo de célula e sua distribuição percentual, entre os três grupos do presente estudo. Não foram realizados ANF em crianças saudáveis (sem IRV) como controle, pela natural dificuldade de obtenção de secreção nasal através deste método. Contudo, alguns estudos, através de lavado nasal, demonstraram que crianças sem IRV não apresentam predominância de neutrófilos em secreção respiratória (NOAH et al, 1995a; MARGUET et al., 2000). Com estes resultados, pode-se inferir que a resposta neutrofílica das vias aéreas, em crianças com IRV, poderia contribuir ativamente para o processo de obstrução
brônquica. Pode-se então admitir que os pacientes que internam com quadro de sibilância secundária à IRV, nos primeiros dois anos de vida, parecem representar o extremo de um espectro de gravidade da infecção viral do aparelho respiratório no qual um ou mais fatores, ainda não conhecidos, poderiam estar facilitando a disseminação da infecção para as vias aéreas inferiores.
Em relação à produção de IL-10, nos casos estudados, encontrou-se um aumento significativo desta citocina, na secreção nasofaríngea de lactentes com primeiro episódio de sibilância, quando comparada ao grupo de IVAS. Estudos anteriores que analisaram a produção de IL-10 na secreção nasal, nesse grupo de pacientes, encontraram resultados opostos. SHEERAN et al. (1999) demonstraram que a IL-10 está aumentada em lactentes com infecção por VSR, quando comparados a um grupo de crianças saudáveis. Foi encontrado também um aumento significativo dos níveis de IL-10 na fase de convalescença, quando comparada com a fase aguda, em um estudo realizado em lactentes com bronquiolite por VSR, através da resposta de cultura de monócitos em sangue periférico. Além disto, a produção elevada nestes pacientes demonstrou uma correlação com sibilância recorrente posterior (BONT et al., 2000). Por outro lado, VAN SCHAIK et al. (1999), em um estudo com delineamento semelhante ao atual, não encontraram diferença significativa nos níveis de IL-10 no ANF, entre grupos de lactentes com sibilância, IVAS e um grupo controle. Apesar dos resultados do estudo de VAN SHAIK et al. (1999), se considerarmos que realmente existem diferenças na produção de IL-10 entre os grupos de sibilância e controles (IVAS e saudáveis), como foi encontrado no presente estudo e nos estudos anteriormente citados (SHEERAN et al., 1999; BONT et al., 2000), pode-se especular que um aumento de IL-10 diminuiria a
resposta imune nas vias aéreas, no início da infecção, permitindo sua disseminação para as vias aéreas inferiores. Atualmente, já se sabe que a IL-10 parece alterar algumas funções de defesa dos neutrófilos, diminuindo sua capacidade funcional (CASSATELA, 1998). Considerando que o neutrófilo é o tipo de célula predominante nas vias aéreas desses lactentes, poderíamos inferir que uma produção aumentada de IL-10, em algumas dessas crianças, através da diminuição da atividade funcional dos neutrófilos em vias aéreas superiores, pode contribuir para a ocorrência de DOB, devido à disseminação da infecção para as vias aéreas inferiores. Ao contrário desta hipótese, não foi encontrada diferença nos níveis de IL-10 no ANF entre os grupos de SR e IVAS no presente estudo. Uma explicação provável para este achado seria que a produção “exacerbada” de IL-10 poderia reduzir-se ou desaparecer com a idade, considerando a diferença de idade entre esses grupos (Tabela 1). Toda a criança nasce com um padrão de resposta imune Th2 que está presente na vida intrauterina (HOLT et al., 1999). O desenvolvimento de doença atópica parece ser causado por um atraso na “maturação” do sistema imune, no que diz respeito a um desvio para resposta tipo Th1, com uma posterior permanência de uma predominância do padrão de resposta imune Th2 (HOLT et al., 1992; PRESCOTT et al., 1998; PRESCOTT et al., 1999). Por isto, como a IL-10 é uma citocina com características funcionais predominantes de resposta Th2 (aquela relacionada à produção de IgE e aumento da proliferação e função de eosinófilos), “estímulos Th1” (infecções e desenvolvimento da flora intestinal), constantes nos primeiros anos de vida, poderiam diminuir tal resposta com o passar dos anos. Por isto, esta hipótese explicaria porque, além do crescimento da via aérea, a maioria dos lactentes com sibilância sem caráter atópico, deixam de apresentar sintomas de obstrução brônquica aos 4-6 anos de vida. Em
resumo, uma produção intrínseca inicial aumentada de IL-10 poderia predispor à sibilância secundária à IRV em lactentes, a qual diminuiria ou desapareceria com o tempo, devido ao desvio natural de resposta imune linfocitária para o padrão Th1, secundária a estímulos naturais. Além disto, esta resposta “exagerada” da IL-10 não estaria diretamente relacionada a um caráter genético atópico.
A ausência de eosinófilos na secreção nasofaríngea neste estudo, somando-se às evidências da literatura (EVERARD et al., 1994; SHEERAN et al., 1999; MARGUET et al., 2000), coloca em dúvida a hipótese de que a sibilância secundária a infecções respiratórias virais do lactente possa ter um caráter de resposta eosinofílica, do tipo alérgico (Th2). Em doenças definitivamente alérgicas, pacientes apresentam eosinófilos em lavado nasal e em lavado bronco-alveolar (NOAH et al., 1995b; MARGUET et al., 2000). STEVENSON et al. (1997) demonstraram que crianças menores de cinco anos de idade, somente com sibilância e IRV, não apresentam eosinófilos no lavado bronco-alveolar, ao contrário de crianças com asma e atopia. Outra evidência, que também enfraquece esta hipótese, é a de que os episódios de sibilância da maioria dos lactentes tendem a se tornar menos freqüentes e menos graves com o passar dos anos (HENDERSON et al., 1979), o que não aconteceria se houvesse um padrão atópico. Com estas informações, resta uma pergunta relevante em relação à origem da produção elevada de PCE nos estudos que analisaram tal proteína, em lactentes com BVA (GAROFALO et al., 1992, GAROFALO et al., 1994; INGRAM et al., 1995; REIJONEM et al., 1997). Em um artigo de revisão, Gleich afirma que amostras originadas de lesões ricas em neutrófilos podem apresentar níveis elevados de PCE (GLEICH, 2000). Esta afirmação origina-se de um estudo no qual foi analisada a
presença de PCE em neutrófilos maduros, através de imunofluorescência indireta e radioimunoensaio (SUR et al., 1998). Com este achado, pode-se concluir que a idéia de que a PCE seja um marcador específico de inflamação associada ao eosinófilo, deve ser interpretada com cuidado. Assim, todos os estudos que encontraram níveis elevados de PCE em crianças com BVA podem estar simplesmente refletindo o grau de resposta neutrofílica aguda que se encontra nesses pacientes, pois nenhum estudo documentou uma presença mínima de eosinófilos nas vias aéreas de lactentes com sibilância.
No presente estudo, não foi encontrada nenhuma correlação entre níveis de IL-10 no ANF e a gravidade dos episódios de sibilância. A ausência de tal achado poderia estar relacionada com a peculiaridade da amostra estudada, na qual os dois grupos com sibilância não apresentavam característica marcada de gravidade. O número de pacientes que apresentava hipoxemia durante a admissão nos grupos de BVA (28%) e SR (5%) não predominava nesta amostra e nenhum paciente necessitou de ventilação mecânica. Portanto, a ausência de pacientes gravemente hipoxêmicos ou em ventilação mecânica torna mais difícil a análise dos fatores de risco de gravidade, neste tipo de estudo.
O aumento no número total de células no ANF de pacientes do grupo de SR, superior ao do grupo de BVA, deste estudo, poderia significar uma maior maturidade do sistema imune ou uma resposta inflamatória mais intensa devida à recorrência da DOB no primeiro grupo. Pelo fato deste achado ser de caráter inespecífico, fica limitada a capacidade de interpretação deste resultado. Contudo, a hipótese de uma progressiva redução da produção de IL-10, secundária a infecções respiratórias virais, em pacientes
com DOB, poderia explicar esta aumentada quantidade de células nas vias aéreas das crianças com sibilância recorrente.
A técnica de ANF utilizada neste estudo demonstrou ser um procedimento simples e apresentou um bom rendimento. Ocorreram poucas perdas relacionadas a dificuldades técnicas do método. Além disto, o alto percentual de viabilidade das amostras demonstra que esta técnica pode ser seguramente utilizada para análise da inflamação (dosagem de citocinas, cultura de células etc.) das vias aéreas. Quanto à identificação de vírus no ANF, o método apresentou um índice de positividade adequado, revelando que a amostra do estudo parece ser representativa em relação à população de lactentes com DOB secundária a IRV. Portanto, o método do aspirado nasofaríngeo, apresentado neste estudo, demonstra ser uma forma útil e simples de colheita de material para analisar marcadores inflamatórios nas vias aéreas, para esses tipos de delineamentos. Em relação ao tipo de resposta celular na via aérea, uma análise de marcadores mais específicos do que a PCE para atividade de eosinófilos, tal como a proteína básica principal, na secreção nasofaríngea de lactentes com sibilância secundária a infecção respiratória viral, pode auxiliar no esclarecimento do papel desta célula na fisiopatogenia desses pacientes.
Concluindo, as infecções respiratórias virais apresentam um caráter inflamatório predominantemente neutrofílico na fase aguda. Além disto, o desenvolvimento de DOB, em lactentes, apresenta mais de um fator causal, incluindo a resposta inflamatória. Contudo, parece que alguns lactentes são predispostos a DOB, por apresentarem uma resposta imune alterada, sem excluir a possível associação com outros fatores, como calibre menor da via aérea. A IL-10, por sua vez, poderia ser uma das
principais citocinas responsáveis pela gênese da DOB nos primeiros meses de vida, devido à sua produção elevada nesses pacientes, especialmente nesta fase do desenvolvimento da resposta imune. Esta função ou atividade poderia diminuir com o passar do tempo devido a estímulos Th1, naqueles pacientes sem predisposição genética para atopia. Estudos longitudinais, com repetidas análises da resposta da IL-10 nesses pacientes, são necessários para um maior esclarecimento desta hipótese.
7 Conclusões
1. Foram encontrados níveis de IL-10 significativamente aumentados no aspirado nasofaríngeo de pacientes com primeiro episódio de sibilância, quando comparados com lactentes com infecções de vias aéreas superiores.
2. Os neutrófilos foram as células predominantes no exame citológico do aspirado nasofaríngeo de lactentes com doença obstrutiva brônquica associados a infecções respiratória virais.
3. Na quase totalidade dos casos, não foram identificados eosinófilos no exame citológico do aspirado nasofaríngeo de lactentes com sibilância secundária a infecções respiratória virais.
4. Não foi encontrada correlação entre níveis de IL-10 em aspirado nasofaríngeo e gravidade do episódio de sibilância em lactentes com infecções respiratórias virais. 5. O aspirado nasofaríngeo demonstrou ser um procedimento simples, seguro e com
bom rendimento para colheita de amostras para análise citológica e de marcadores inflamatórios em lactentes.
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