3.5.1 – Determinação da concentração celular
A biomassa foi quantificada mediante gravimetria, sendo uma quantidade (10 mL) do meio de cultivo filtrada em papel filtro Whatman previamente pesado e o material submetido
à secagem em forno microondas durante 15 minutos em potência 2 (180 W) conforme metodologia apresentada por Orozco; Pereira e Kilikian (2003), obtendo-se a quantidade de biomassa retida em um volume de meio conhecido.
3.5.2 - Determinação do pH
O pH foi determinado em pHmetro digital Analion.
3.5.3 - Determinação da concentração de pigmentos
O pigmento vermelho foi quantificado em espectrofotômetro SP-1100 Séries Modelo SP-105 nos seguintes comprimentos de onda: 380 nm (pigmento amarelo), 420 nm (pigmento laranja) e 480 nm (pigmento vermelho) (HAJJAJ et al., 2000a). Ainda foi definido por Hajjaj
et al. (1998), que 1 unidade de absorbância UDO480 corresponde a 15 mg.L-1 de pigmento.
3.5.4 - Determinação da concentração de glicose
O método utilizado foi o com DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico) conforme metodologia proposta por Miller et al., (1959), em espectrofotômetro SP-1100 Séries Modelo SP-105 a 540 nm e comparado com uma curva padrão de glicose na faixa de 0 a 3 g.L-1
3.5.5 - Determinação da concentração de glicerol
O glicerol foi determinado por método espectrofotométrico descrito por Lambert e Neish (1950) apresentado por Araújo (2006), após reação com ácido periódico. Nesta reação,
o glicerol é oxidado quantitativamente a formaldeído, determinado em comprimento de onda de 570 nm em espectrofotômetro SP-1100 Séries Modelo SP-105.
3.5.6 – Parâmetros cinéticos
As velocidades específicas máximas de crescimento durante a fase exponencial foram calculadas a partir do coeficiente angular da curva linearizada pelo logarítimo neperiano da biomassa residual com o tempo de acordo com a Equação 3.1.
t X
X)=ln( )+µmáx
ln( 0 (3.1)
Sendo:
X : biomassa ao longo da fase exponencial (g.L-1);
X0 : biomassa no início da fase exponencial (g.L-1);
µmáx : velocidade específica máxima de crescimento celular (h-1);
t : tempo (h).
A produtividade máxima em células (Pcélulas) foi calculada pela diferença entre a maior
concentração celular (biomassa) em um instante t e a concentração celular (biomassa) inicial dividida pelo intervalo de tempo correspondente, conforme Equação 3.2.
0 ) ( ) ( 0 t t X X P MÁXt t células − − = (3.2) Sendo:
Pcélulas : produtividade máxima de crescimento (formação de células) no instante de
tempo (t – t0) (g.h-1);
XMÁXt : máxima formação de biomassa no instante de tempo t;
Xt0 : formação de biomassa no tempo t0;
t : tempo para atingir o valor máximo biomassa; t0 : tempo inicial do cultivo.
A produtividade máxima de produção de pigmentos foi calculada pela diferença entre a maior concentração de pigmentos (UDO) em um instante t e a concentração inicial de pigmentos dividida pelo intervalo de tempo correspondente, conforme Equação 3.3.
0 ) ( ) ( 0 t t UDO UDO P MÁXt t M − − = (3.3) Sendo:
PM: produtividade máxima de formação de pigmentos no instante de tempo (t – to)
(UDO.h-1);
UDOt : máxima quantidade de pigmento no instante de tempo t;
UDOt0 : quantidade de pigmento no tempo t0;
t : tempo para atingir o valor máximo de UDO; t0 : tempo inicial do cultivo.
As velocidades específicas de produção de pigmentos vermelhos foram calculadas através da Equação 3.4, conforme metodologia proposta por Le Duy e Zadic (1973) apresentada por Schmidell et al. (2001).
dt dP X p= 1 ∗ µ (3.4) Sendo:
µp: velocidade específica de produção de pigmentos vermelhos (UDO480nm.g-1.h-1);
X : biomassa (g.L-1) no instante de tempo t;
P : concentração de pigmentos vermelhos (UDO480);
t: tempo (h);
As velocidades específicas de crescimento foram calculadas através da equação 3.5, conforme metodologia proposta por Le Duy e Zadic (1973).
dt dX X x= 1 ∗
Sendo:
µx: velocidade específica de crescimento (h-1);
X : biomassa (g.L-1) no instante de tempo t; t: tempo (h).
Os fatores de conversão de substrato em células foram obtidos a partir do coeficiente angular da porção linear do gráfico da quantidade analisada (biomassa) contra a quantidade de substrato, de acordo com as Equações 3.6 e 3.7.
S
X
Y
X S∆
∆
=
/ (3.6)G
X
Y
X G∆
∆
=
/ (3.7) Sendo:YX/S : fator de conversão de glicose em biomassa (g.g-1);
YX/G : fator de conversão de glicerol em biomassa (g.g-1);
X : aumento da biomassa no intervalo de tempo t (g.L-1); G : consumo de glicerol no intervalo de tempo t (g.L-1).
S : consumo de glicose no intervalo de tempo t (g.L-1).
Os fatores de conversão de substrato em pigmentos vermelhos também foram obtidos a partir do coeficiente angular da porção linear do gráfico da quantidade analisada (pigmento) contra a quantidade de substrato, de acordo com as Equações 3.8 e 3.9.
S
P
Y
P S∆
∆
=
/ (3.8)G
P
Y
P G∆
∆
=
/ (3.9) Sendo:YP/S : fator de conversão de glicose em pigmento (UDO480.g-1);
YP/G : fator de conversão de glicerol em pigmento (UDO480.g-1);
P : aumento da concentração de pigmentos vermelhos no intervalo de tempo t (UDO480);
G : consumo de glicerol no intervalo de tempo t (g.L-1). S : consumo de glicose no intervalo de tempo t (g.L-1).
3.6 CRESCIMENTO RADIAL
No preparo do inóculo foram transferidas duas alçadas do microrganismo para tubos de ensaio contendo 0,3 mL de ágar 0,2% para evitar o espalhamento de esporos na superfície da placa durante a inoculação (GABIATTI JR et al., 2004).
Foram estudados oito meios diferentes conforme apresentado por PASTRANA et al., 1995. As concentrações de glicerol estudadas foram de 1, 2 e 3% e de glicose foi de 1%. Além das placas teste contendo glicerol ou glicose como fontes de carbono, foram realizadas medidas em placas contendo meio padrão: PDA (Potato Dextrose Agar), ágar e ágar+nutrientes.
Os meios, autoclavados, foram vertidos em placas de Petri. Após solidificados, fez-se uma inoculação pontual no centro da placa com o auxílio de uma ponteira estéril. Molhou-se a ponta da ponteira no inóculo e tocou-se no centro da placa contendo o meio. Incubou-se em estufa a 30ºC e mediu-se, com auxílio de uma régua, o diâmetro da área recoberta pelo fungo. As medidas foram realizadas a cada 24 h.
Com a finalidade de se obter medidas confiáveis foram desenhadas três raias no fundo das placas de Petri. Foram medidos três diâmetros em cada placa, garantindo assim que as culturas que não apresentassem um crescimento regular tivessem calculado seus diâmetros médios. Os experimentos foram realizados em seis placas para cada meio de cultivo, e com os três valores dos diâmetros, calculou-se o diâmetro médio para cada tempo.
A velocidade de crescimento radial nos meios utilizados foi determinada pela declividade da reta obtida pela regressão linear, conforme a Equação (3.10).
t
V
a
t
r(
)=
+
cr⋅
(3.10) Em que: r(t) é o raio da colônia (mm); a é a constante da regressão linear,Vcr é a velocidade de crescimento radial (mm.h-1);
Análise estatística:
Para avaliação das velocidades de crescimento radial foi necessária a utilização de ferramentas estatísticas. A análise estatística utilizada para avaliar as diferentes velocidades de crescimento obtidas para diferentes meios constou do teste de comparação de declividade de retas proposto por Zar (1984) apresentado por Gabiatti Junior et al. (2003) e teste-t. O teste de comparação de declividades consiste na realização de regressões lineares para as curvas de crescimento radial em função do tempo. Neste teste é verificado se existe diferença significativa entre as declividades das curvas de regressão. Para isso é empregado o procedimento de análise de covariância. A base de cálculo necessária para comparar linhas de regressão para os tratamentos requer os valores: x2, y2, x.y e o resíduo SS e DF para cada
linha computada.
O teste para comparação de declividades das linhas de regressão compreendeu no cálculo do valor de F, dado pela Equação 3.11.
DFp SSp K SSp SSc F ( 1) ) ( − − = (3.11)
Os valores de SSc, SSp e DF são dados pelas Equações 3.12, 3.13 e 3.14.
−
=
K iSSi
SSp
1 (3.12) − = 2 2 2 ( . ) x y x y SSc (3.13) = − = K i K n DFp 1 2 (3.14)Sendo: n = tamanho da amostra para cada regressão; K = número de regressões;
x2 = soma dos quadrados da variável independente da regressão linear;
y2 = soma dos quadrados da variável dependente da regressão linear; x.y = soma do produto da variável dependente e independente;
SSc = resíduo para a regressão comum; SSp = resíduo para a regressão ponderada; DF = resíduo ponderado;
Se a hipótese de que todas as declividades das retas são iguais é nula, procede-se um teste de comparação múltipla a fim de determinar qual coeficiente angular da regressão de determinada população difere das demais.
Foi utilizado o teste-t para verificar a diferença entre cada par de declividades, utilizando o Software Statistica 6.0.
3.7 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
O meio de cultivo foi submetido à otimização visando maximizar a produção de pigmentos vermelhos, através de delineamento fatorial de metodologia de superfície de resposta. As variáveis estudadas foram: concentração de substrato (glicerol) e concentração de fonte de nitrogênio (GMS), em três níveis de variação (32). A definição e os níveis estudados seguiram o delineamento estatístico experimental Box-Behnken conforme a Tabela 3.1.
O planejamento foi constituído por um grupo de ensaios com nove frascos mais uma repetição do ponto central, totalizando 10 frascos. Os ensaios foram realizados em duplicata.
Para a análise estatística, análise dos efeitos, construção de superfície de resposta e teste-t, foi utilizado o software Statistica 6.0.
TABELA 3.1 - Variáveis e níveis de variação do delineamento 32. Variáveis decodificadas
-1
Níveis
0 +1
Concentração de glicerol (g.L-1) 10 40 70 Concentração de glutamato monossódico (g.L-1) 1 5 9
4 AVALIAÇÃO DA UTILIZAÇÃO DE GLICEROL COMO SUBSTRATO PARA O