Métodos Analíticos

4.2.7.1 Determinação da concentração de glicose

A concentração de glicose foi estimada pelo método de ácido dinitrosalicílico (DNS) mediante curva de calibração que correlaciona a absorbância a 540 nm e a concentração em g/L (SUMMER, 1924; MILLER, 1959). Foram pipetados 1000 μL de cada diluição das amostras em tubos de ensaio e adicionados 1 mL do reagente DNS a cada tubo. Os tubos foram aquecidos em banho-maria durante 5 minutos e resfriados a temperatura ambiente. Em seguida, foram feitas as leituras de absorbância em 540 nm em espectrofotômetro de UV-visível (Modelo Cary 50 Conc (Varian). As absorbâncias obtidas foram utilizadas para a construção da curva padrão de glicose: y=0,9857x – 0,0504; R2 =0,9997.

4.2.7.2. Extração de lipídios da biomassa microbiana

A fim de estabelecer o método mais adequado para extração dos lipídios da biomassa celular foram testadas cinco metodologias, incluindo métodos clássicos como extração à solvente em Soxhlet, Folch et al (1957) assistido por ultrassom, Bligh & Dyer (1959) adaptado, extração com 2-Etoxietanol (SILVA et al., 2014) e extração com etanol assistida por micro-ondas.

Os testes foram feitos com a biomassa de M. circinelloides URM 4182 cultivada segundo metodologia descrita na seção 4.3.1.1. Após o período de crescimento, as células foram separadas do meio de cultivo por centrifugação a 1570 g por 15 min e a biomassa liofilizada ou úmida foi submetida a diferentes tratamentos para extração de lipídios. Após o período de incubação, a biomassa foi filtrada e o extrato lipídico obtido foi seco em rota- evaporador para remoção do solvente e em seguida transferido para estufa (60 ºC) até obtenção de massa constante. A quantificação da massa total dos lipídios foi determinada pelo percentual de lipídios em g.100g-1 de biomassa. O critério de seleção do método de extração foi baseado no maior teor lipídico obtido (%).

- Método “Bligh and Dyer” modificado

Os lipídios foram extraídos das células previamente liofilizadas utilizando metodologia modificada descrita por Bligh & Dyer, 1959 (Figura 4.11). Inicialmente foi adicionado solvente à biomassa na seguinte ordem: clorofórmio, metanol, água 1: 2: 0,8 (v/v/v). As amostras foram agitadas por alguns minutos até completa homogeneização dos solventes. Na sequência, manteve-se em agitação branda por 18 h. A separação das fases foi realizada em funil de separação adicionando-se clorofórmio e água para obtenção de separação da fase apolar (lipídica) e polar.

Figura 4.11. Extração de lipídio pelo método ―Bligh & Dyer‖ modificado

Fonte: própria

- Método Folch empregando ultrassom de sonda

Os lipídios foram extraídos das células previamente liofilizadas empregando-se a metodologia de Folch e colaboradores (1957), com algumas modificações. As extrações foram realizadas em Ultrassom (Modelo-UP200S/UP400S, Hielscher-Ultrasound Technology) com processadores ultrassônicos que emitem potência entre 200 W e 400 W. O procedimento teve início adicionando-se uma mistura de clorofórmio–metanol (2:1) em relação à massa seca das células, juntamente com um terço do volume de clorofórmio para completa homogeneização da biomassa no solvente. Na sequência, a amostra foi centrifugada por alguns minutos de modo a separar o conteúdo celular extrato contendo óleo e solvente. O sobrenadante recolhido foi misturado a uma solução de KCl 0,88% (m/v) (1/4 em relação ao volume da amostra) a fim de remover os componentes não lipídicos. A fase inferior foi transferida a um funil de separação, adicionando-se uma mistura de metanol-água (2:1). Após a separação das fases, o extrato lipídico obtido foi

seco em rota-evaporador para remoção do solvente e em seguida transferido para estufa (60 ºC) até obtenção de massa constante.

Figura 4.12. Extração de lipídio pelo método Folch empregando ultrassom de sonda

Fonte: própria

- Método empregando extrator Soxhlet

Amostras de aproximadamente 11 g de biomassa liofilizada foram adicionadas ao cartucho de celulose. A extração foi feita por 8 horas, em aparelho Soxhlet com 200 mL de solvente (clorofórmio: metanol (2:1), etanol e hexano). Após a extração, o solvente foi evaporado em rota evaporador e a fração lipídica foi seca até obtenção de massa constante em estufa. Essa metodologia é baseada em D’oca et al. (2011). Os procedimentos desse método foram feitos em duplicata.

- Método empregando agitação magnética/ 2-Etoxietanol

Em um Becker de 100 mL foi colocado a biomassa com umidade de aproximadamente 20% (0,5g biomassa seca) suspensa em 25 mL de 2-Etoxietanol (Etilglicol). A extração foi conduzida em 3 ciclos a 60 °C por 30 min sob agitação magnética contínua trocando o solvente a cada ciclo. O extrato foi recolhido a cada ciclo por filtração e a biomassa foi novamente submetida à extração até completarem os três ciclos. Ao final, o extrato obtido foi levado ao rota-evaporador para esgotamento do solvente (SILVA et al., 2014).

- Método empregando micro-ondas/etanol

Os lipídios foram extraídos das células com umidade entre 70-85% e a extração foi realizada utilizando 0,05 g de biomassa fúngica (base seca) suspensa em 25 mL de etanol 96% utilizado como solvente, em um reator de micro-ondas comercial (modelo Discover/University-Wave, Cem Corporation), constituído por uma câmara cilíndrica interna com 75 mm de diâmetro e 100 mm de altura, com agitador magnético e controle de temperatura por fluxo de ar comprimido (Figura 4.13a), baseando-se na metodologia descrita por Cravotto et al. (2008). A temperatura dentro da câmara foi controlada mediante variação automática da potência de micro-ondas sendo a máxima de 200 W. Foi avaliada a concentração de lipídios (%, m/m) obtida em tratamentos extrativos independentes de 10, 30 ou 60 min cada tratamento e temperatura de 50 ou 60 °C.

Neste trabalho também foram realizadas extrações conduzidas em três ciclos de 1 hora cada, a 60 °C em sistema de digestão de amostras com radiação na região das micro- ondas (Titan MPS™ PerkinElmer®) com uma plataforma giratória com capacidade para 16 frascos TFM (com volume de 75 mL e que suportam uma pressão de 40 bar), com controle de temperatura direto dentro da câmara (DTC ™), controle de pressão (DPC ™) e tela para programação (Figura 4.13b). Cada vaso continha biomassa (1,0 g seca) com umidade entre 70-85% e 50 mL de etanol 96%. Este último método não apresentou diferença quanto aos rendimentos de extração em relação ao método utilizando o reator de micro-ondas comercial modelo Discover/University-Wave, Cem Corporation.

Figura 4.13. Extração de lipídio pelo método empregando micro-ondas/etanol

a) b)