Métodos Analíticos

3.11.1 pH

O pH foi determinado através de leitura direta, em potenciômetro de marca Marconi®, modelo PA200, calibrado a cada utilização com soluções tampão de pH 4,0 e pH 7,0 conforme a AOAC (1992).

3.11.2 Determinação de açúcares redutores

Os açúcares redutores foram determinados de acordo com o método de MILLER (1959), o qual consiste na reação da amostra com o reagente DNS (ácido dinitrosalicílico) a 100°C durante 5 minutos, sendo este um método colorimétrico onde a concentração dos açúcares redutores após a reação com DNS é proporcional a absorbância no espectro visível a 540 nm.

Para a determinação das concentrações de açúcares na amostra foi feita uma curva padrão de calibração através de soluções padrão em concentrações conhecidas (faixa de 0,2 a 2,0 g/L). Esta curva de calibração é uma reta passando pela origem dos eixos, cuja equação é determinada através de regressão linear.

A determinação da curva de calibração foi feita adicionando-se 125 µL de cada solução padrão em um tubo de ensaio contendo 125 µL da solução de DNS. A mistura foi aquecida à 100°C por 5 minutos e resfriada posteriormente em banho de gelo. Após atingir a temperatura ambiente, a mistura foi diluída com 2.250 µL de água destilada e a leitura da absorbância no comprimento de onda de 540 nm foi realizada em espectrofotômetro Spectrum®, modelo SP2000UV. Para os ensaios foi realizado o mesmo procedimento utilizado para a construção da curva padrão

3.11.3 Determinação de proteínas

Para determinação da massa proteica total foi utilizado o método de BRADFORD (1976), que consiste na reação da proteína com o corante Coomassie Brilliant Blue G250. Para isso foi preparada uma solução contendo 0,06 % de Coomassie Brilliant Blue G250 em 1,5 % HCl (p/v), a qual foi posteriormente filtrada em papel de filtro Whatman n° 1. A partir dessa solução foi preparada uma curva padrão com albumina bovina (BSA) em concentrações conhecidas (faixa de 10 a 200 µg/mL). Foram adicionados 50µl de cada solução estoque, 700µL de H2O

destilada e 750 µL do Coomassie a tubos de ensaio, os quais foram agitados imediatamente após a adição dos reagentes. Após 5 minutos, a leitura da absorbância a 595 e 465 nm contra a água foi realizada em espectrofotômetro Spectrum®, modelo SP2000UV. A razão das absorbâncias (595 nm/465 nm) foi

plotada em função da massa de BSA e a equação da reta foi obtida por regressão

linear dos pontos.

Para os ensaios foi realizado o mesmo procedimento utilizado para a construção da curva padrão e a partir da média das razões das absorbâncias (595 nm/465 nm), foi calculada a massa de proteína através da curva padrão. Os ensaios foram realizados em triplicata.

3.11.4 Composição mineral do suco de caju

A composição mineral do suco de caju foi avaliada através da determinação de sódio, potássio, fósforo, cálcio, magnésio, enxofre, cobre, ferro, zinco e manganês. As análises para a quantificação de minerais foram realizadas em triplicata, sendo as amostras inicialmente submetidas ao processo de digestão durante 24 horas com mistura ácida nitro-perclórica na proporção de 3:1 (600 mL de HNO3 65% p.a e 200 mL de HClO4 72%). A quantificação de sódio e potássio foi

realizada por fotometria de emissão de chamas em um equipamento DIGIMED modelo DM-61. Os demais minerais foram quantificados por espectrofotometria de

absorção atômica em um equipamento Perkin-Elmer, modelo A-Analyst 300 (MALAVOLTA, VITTI e OLIVEIRA, 1997).

3.11.5 Determinação do crescimento microbiano

A determinação do crescimento microbiano foi realizada através de leitura da absorbância a 590 nm em espectrofotômetro Spectrum®, modelo SP200UV. O procedimento consistiu em diluir uma alíquota da suspensão contendo as células em água destilada e realização da leitura da absorbância contra um branco com água. A massa seca celular foi calculada através de uma curva de calibração construída com a determinação do peso seco das células seguido de diluição (Rodrigues et al., 2003).

3.11.6 Determinação da Dextrana

A dextrana precipitada, conforme descrito no item 3.6, foi re-suspensa em água destilada e determinada segundo o método fenol ácido sulfúrico para determinação de carboidratos totais (DUBOIS et al., 1956).

3.11.7 Determinação da atividade enzimática

A atividade enzimática no caldo fermentado foi determinada através da quantificação da frutose liberada em meio reacional contendo sacarose como substrato (HEINKE et al., 1999).

A atividade enzimática foi determinada em termos de unidade de dextrana- sacarase (UDS/mL). A UDS nada mais é do que a quantidade de enzima que converte 1 mg de sacarose em dextrana a 30°C liberando 0,52 mg de frutose em 1 hora. Entretanto não é necessário que a cinética seja determinada no período de 1 hora, pois trata-se de uma reta.

Realizou-se o cálculo da atividade enzimática utilizando a seguinte equação:

( Atividade UDS / mL) = 1 β1 60 d (9)

α1 0,52

Onde:

α1 coeficiente angular da curva de calibração de DNS (mg/ABS.ml)

β1 coeficiente angular da reta da curva cinética (ABS/min)

60 conversão do tempo de minutos para hora d diluição da amostra

O coeficiente angular da curva foi calculado da seguinte forma:

β = ABS10 – ABS0 (10)

10

ABS10 valor médio das leituras de absorbância no tempo 10 minutos

ABS0 valor médio das leituras de absorbância no tempo zero

Para a determinação da atividade da enzima obtida no meio sintético, foram preparados 100 ml de uma solução reativa contendo 18,2 ml de uma solução estoque de sacarose (600 g/L) em tampão acetato de sódio 20 mM com 0,05 g/L de CaCl2 e 4,5 ml de solução tampão de acetato de sódio 20 mM com 1,2 g/L de CaCl2.

O pH da solução foi ajustado para 6,5. Uma alíquota de 400 µL desta solução de atividade foi adicionada a dois tubos de ensaio e em seguida, uma alíquota de 100 µL do caldo fermentado centrifugado foi adicionada a cada tubo de ensaio, que foram incubados a 30°C em banho termostatizado. Foram adicionados 500 µL do reagente de DNS a cada um dos tubos nos tempos 0 e 10 minutos respectivamente. Os tubos foram então aquecidos por 5 minutos a 100°C e resfriados à temperatura ambiente em banho de gelo. A cada um dos tubos foram adicionados 4,5 mL de H2O

destilada. Os tubos foram homogeneizados e a leitura foi realizada a 540 nm contra o branco da solução de atividade.

Para a determinação da atividade da enzima obtida no suco de caju, uma alíquota de 400 µL da solução de atividade foi adicionada a dois tubos de ensaio e em seguida, uma alíquota de 100 µL do caldo fermentado centrifugado foi adicionada a cada tubo de ensaio, que foram incubados a 30°C em banho termostatizado. Foi então adicionado 1500 µL de etanol a cada um dos tubos nos tempos 0 e 10 minutos respectivamente. As amostras foram diluídas e foi realizado o procedimento de determinação de açúcares redutores pelo método de DNS (MILLER, 1959).

3.11.8 Detecção de oligossacarídeos através de cromatografia de camada delgada (CCD)

Os oligossacarídeos prebióticos foram detectados através de cromatografia de camada delgada (CCD), em placas de sílica gel da marca Whatman, sendo utilizadas placas tipo K6 (sílica gel 60 A). Foi utilizada a técnica de múltiplas ascensões, que permite uma melhor separação dos produtos de interesse, e placas de dimensões de 20 x 20 cm permitindo a corrida de aproximadamente 15 amostras simultâneas. Para a separação dos oligossacarídeos foi utilizado o sistema acetonitrila/acetato de etila/1-propanol/água (85:20:50:90), sendo realizadas duas ascensões (RODRIGUES, 2003).

Após diluição adequada, as amostras foram aplicadas na borda inferior da placa à uma distância de 1,5 cm da borda. Foram aplicados 10 µL de cada uma das amostras e mais os padrões de sacarose, frutose e glicose para identificação das respectivas manchas. Para aplicação das amostras, foram utilizadas micropipetas. As placas foram colocadas na câmara de desenvolvimento saturada com a fase móvel. Ao término de cada ascensão a placa foi seca com secador de cabelos para remoção completa da fase móvel.

Como sistema de detecção, foi utilizada uma solução constituída de 0,3 % (p/v) de 1- naftiletilenodiamina e 5 % (v/v) de H2SO4 concentrado em metanol. Ao

desenvolvimento, secas conforme procedimento descrito acima, e mergulhadas rapidamente no reagente de detecção. Após secagem natural em capela (à temperatura ambiente e sem uso do secador de cabelos), as placas foram colocadas em um forno a 120 °C por 10 minutos para revelação das manchas.