2. Aminas bioativas
2.3. Aminas bioativas em cogumelos
2.3.3. Métodos analíticos para determinação de aminas bioativas em
São diversas as razões para determinar aminas bioativas em cogumelos, dentre elas, a presença de aminas bioativas são indicadoras do potencial biológico, da qualidade e do efeito adverso (Křížec, 1991; Kalač, 2014). Dessa forma torna-se necessário o desenvolvimento de métodos confiáveis, sensíveis e rápidos para determinação das aminas bioativas em cogumelos.
Devido à propriedade química das aminas bioativas, a determinação dessas substâncias em alimentos é desafiadora e trabalhosa (Křížec, 1991; Önal et al., 2013; Papageorgiou et al., 2018). As principais características que tornam difícil a determinação de aminas bioativas em alimentos são a ausência de um cromóforo e a difícil separação em coluna de fase reversa.
Diversas técnicas têm sido relatadas para análise de aminas bioativas em alimentos, dentre elas, a cromatografia líquida de alta e ultra eficiência (HPLC/UHPLC), a cromatografia gasosa (GC) e a eletroforese capilar (CE) (Önal et al., 2013). Além desses métodos, outras abordagens não cromatográficas para determinação de aminas bioativas em alimentos foram desenvolvidas como métodos imuno-enzimáticos, kits para determinação de histaminas semi-quantitativo, biosensores e amperométricos (Papageorgiou et al., 2018). Os métodos utilizados para preparo de amostra e detecção e quantificação de aminas bioativas em cogumelos estão demonstrados nas Tabelas 2 e 3, respectivamente.
Em geral, as aminas bioativas são extraídas dos cogumelos mediante a extração ácida com ácido perclórico (HClO4) (Yamoto et al., 1982; Yen, 1992; Kalač & Křížec, 1997) ou ácido tricloroacético (TCA) (Okamoto et al., 1997; Nishimura et al., 2006; Reis, 2014) seguido de agitação, centrifugação e separação do sobrenadante por filtração simples.
Tabela 2. Métodos de preparo da amostra para determinação de aminas bioativas em cogumelos.
Aminas bioativas Preparo da amostra Referência
CAD, EPD, EPM PUT
Cogumelo foi homogeneizado com HClO4a 2% agitado e mantido a 4˚C durante a noite. A suspensão foi centrifugada e o
precipitado foi lavado duas vezes com HClO4 a 2%, centrifugado novamente, filtrado e aplicado na coluna de resina de troca
catiônica (9 mm id; 3 mL de volume). A coluna foi lavada sucessivamente com tampão de fosfato 0,1 mol/L contendo NaCl a 0,1 M e HCl 1 mol/L. O eluato foi colhido e adicionado padrão interno. A mistura foi evaporada até em evaporador rotativo a 50 °C sob vácuo. O resíduo foi recuperado com adição de NaOH a 10% e cloroformato de etilo. A mistura foi agitada e os derivatizados resultantes foram extraídos 3 vezes com de éter dietílico. Os extratos combinados foram evaporados até à secura a 50 ° C com uma corrente suave de nitrogênio. O resíduo foi dissolvido de acetato de etilo e adicionou-se alguns grãos de Na2SO4 anidro.
Yamoto et al.,
1982
CAD, FEM, HIM, PUT, TIM, TRP
O cogumelo foi homogeneizado por HClO4 a 6%. A mistura foi armazenada a 4˚C durante a noite e filtrada. O filtrado foi ajustado
para pH 6,5 com KOH, depois armazenado a 4 ˚C durante 2 h e filtrado. O filtrado foi derivatizado com cloreto de dansila.
Yen, 1992
PUT, CAD Cogumelo foi homogeneizado com HClO4 e agitado. Kalač & Křížec,
1997 AGM, CAD, EPD,
EPM, HIM, PUT
Cada cogumelo foi homogeneizado em ácido tricloroacético 5% e depois centrifugado. Uma alíquota do sobrenadante foi aplicada a uma coluna de resinas de troca iônica (Muromac CR-70) para eliminar os aminoácidos e peptídeos que interferem nas análises. As poliaminas foram eluídas com HCl 6 mol/L, que foi subsequentemente removido por evaporação.
Okamoto et al., 1997
AGM, CAD, EPD, EPM, PUT
Os cogumelos foram congelados em nitrogênio líquido, cortados em pequenos pedaços e homogeneizados com ácido tricloroacético a 5%. Em seguida foi centrifugado e o sobrenadante foi purificado em duas colunas de troca iônica TSK gel (4,6 x 50 mm) para separar as poliaminas dos aminoácidos.
Nishimura et al., 2006
EPD, EPM, PUT As amostras foram homogeneizadas em ácido tricloroacético a 5% e armazenadas a -20˚C até a análise. As amostras foram
centrifugadas sobrenadantes contendo poliaminas livres foram analisados.
Nishibori et al., 2007
EPD, EPM, FEM, PUT, TIM, TRP
Os cogumelos em pó liofilizados foram homogeneizados com H2ClO4 a 0,6 mol/L. A mistura foi agitada e centrifugada. O
sobrenadante foi filtrado e as aminas extraídas foram derivatizadas com cloreto de dansila.
Dadaková et al., 2009
AGM, CAD, EPM, FEM, HIM, PUT, SRT, TIM, TRP
Cogumelos frescos foram homogeneizados com ácido tricloroacético. As amostras foram agitadas e centrifugadas. O sobrenadante foi filtrado.
Reis, 2014
AGM = agmatina, CAD = cadaverina, HIM = histamina, FEM = feniletilamina, PUT = putrescina, SRT = serotonina, TRP = triptamina, TIM = tiramina, EPD = espermidina, EPM = espermina.
para eliminar interferentes como aminoácidos e peptídeos (Yamoto et al., 1982; Okamoto et al., 1997; Nishimura et al., 2006).
As técnicas de separação utilizadas foram a cromatografia gasosa (Yamoto et al., 1982), a cromatografia líquida com derivatização pré-coluna (Yen,1992; Kalač & Křížec, 1997; Dadakova et al., 2009) e derivatização pós-coluna (Okamoto et al., 1997; Nishimura et al., 2006; Nishibori et al., 2007; Reis, 2014). O método por cromatografia gasosa (Yamoto et al., 1982) depende de preparo de amostra extenso e trabalhoso, com inúmeras etapas, incluindo hidrólise ácida, purificação com coluna de troca iônica para separação das aminas bioativas de aminoácidos e peptídeos e derivatização no intuito de permitir o arraste das aminas pela coluna. A separação foi feita em coluna empacotada, o que dificulta a reprodutibilidade do método. A identificação foi realizada mediante a detecção por espectrometria de massas e quantificação através da detecção por ionização de chamas (FID).
Com avanço da cromatografia líquida de alta eficiência, essa técnica foi sendo preferida para determinação de aminas bioativas em alimentos e, portanto, nos cogumelos (Önal et al., 2013; Papageorgiou et al., 2018). Pela estrutura química (Figura 4), as aminas bioativas apresentam elevada polaridade e, assim, são separadas com melhor eficiência em colunas de troca iônica, comparada a coluna C18. Dessa forma, a derivatização pré-coluna tem sido utilizada por diversos autores (Okamoto et al., 1997; Nishimura et al., 2006; Nishibori et al., 2007; Reis, 2014) para determinação de aminas bioativas em alimentos a fim de alterar as propriedades físico químicas desses compostos e oferecer um grupo hidrofóbico, aumentando a interação do derivatizado com a fase estacionária. O derivante cloreto de dansila tem sido o reagente mais usado para derivatização de aminas. Os derivatizados de dansila podem ser separados tanto por fase reversa quanto por fase polar. A fase reversa é mais usada por apresentar melhor resolução na separação. Os derivatizados de dansila podem ser detectados por detectores ultravioleta ou por de fluorescência (Yen, 1992; Dadaková et al., 2009).
Tabela 3. Métodos de detecção e quantificação de aminas bioativas em cogumelos.
Aminas bioativas Sistema/Fase estacionária Derivatização/ Detecção Tempo de corrida Referências
CAD, EPD, EPM PUT
Cromatógrafo gasoso modelo Shimadzu 4CM com detector de ionização por chamas
Cromatógrafo gasoso modelo Shimadzu LKB 9000 com detector por espectrometria de massas Coluna de vidro (3,0 x 500 mm)
Ionização por chamas (FID) Espectrometria de massas (MS)
20 min Yamoto et al., 1982
CAD, FEM, HIM, PUT, TIM, TRP
HPLC Hitachi com detector UV-Vis Derivatização pré-coluna com cloreto de
dansila Detecção a 254 nm
Não informado Yen, 1992
PUT, CAD HPLC detector UV/vis
Coluna C18 modelo SGX-C18 (3,0 x 150 mm, 5µm)
Derivatização com cloreto de benzoíla Detecção a 254 nm
Não informado Kalač & Křížec, 1997
AGM, CAD, EPD, EPM, HIM, PUT
HPLC
Coluna de troca ionica modelo TSK-gel Aminopak column
Detecção pós coluna por fluorescência por reação com ortoftaladeído
Não informado Okamoto et al., 1997
AGM, CAD, EPD, EPM, PUT
HPLC
Coluna de troca iônica modelo TSK- gel IEX215 (4,0 x 80 mm)
Detecção pós coluna por fluorescência por reação com ortoftaladeído excitação a 340 nm e emissão a 455 nm
102 min Nishimura et al., 2006
EPD, EPM, PUT HPLC Hitachi modelo 2619F
Coluna com resina de de troca cationica (4,0 x 50 mm)
Detecção pós coluna com ortoftaladeído Fluorescência
Não informado Nishibori et al., 2007
EPD, EPM, FEM, PUT, TIM, TRP
HPLC modelo RR-LC Agilent
Coluna C18 Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 x 50 mm, 1,8 µm).
Derivatização pré-coluna com cloreto de dansila Detecção a 225 nm
12 min Dadaková et al., 2009
AGM, CAD, EPM, FEM, HIM, PUT, SRT, TIM, TRP
HPLC modelo Shimadzu LC-10AD acoplado com espectrofluorímetro
Coluna C18 Novapack (3,6 x 300 mm) (Waters)
Detecção pós coluna com ortoftaladeído Fluorescência excitação a 340 nm e emissão a 455 nm
60 min Reis, 2014
AGM = agmatina, CAD = cadaverina, HIM = histamina, FEM = feniletilamina, PUT = putrescina, SRT = serotonina, TRP = triptamina, TIM = tiramina, EPD = espermidina, EPM = espermina.
O cloreto de benzoíla também pode ser usado como derivante (Křížec, 1991; Kalač & Křížec, 1997) e traz algumas vantagens, por ser um derivante barato, de fácil acesso e a duração do derivatizado é menos crítica que o derivatizado cloreto de dansila. O processo de reação acontece à temperatura ambiente e não há necessidade de tampão. Em comparação com dansilaminas, benzamidas não são sensíveis a luz e podem ser estocadas a -20 ˚C por diversos meses (Křížec, 1991).
Na técnica de derivatização pós-coluna, o reagente orto-ftalaldeído foi utilizado como derivante (Okamoto et al., 1997; Nishimura et al., 2006; Nishibori et al., 2007) ou par-iônico (Reis, 2014). A separação cromatográfica por par-iônico permite o uso de coluna de fase reversa e oferece seletividade adicional ao permitir manipular a concentração do reagente que forma o par iônico. A eficiência da separação se dá pela restauração do par iônico ao longo dos gradientes na corrida (Collins et al., 2007). A técnica de troca iônica consiste em uma fase estacionária com uma matriz na qual são ligados covalentemente grupos iônicos, cuja carga é neutralizada pelo contra-íon. A eficiência da separação se dá pela capacidade de troca iônica e a seletividade e retenção na troca iônica é fortemente influenciada pelo tamanho da carga dos analitos, tipo de trocado iônico, temperatura da coluna e diversas características da fase móvel, tais como pH, força iônica, vazão, modificador orgânico, contra-íon, concentração do contra-íon e tipo de solução tampão (Collins et al., 2007). Ambas as técnicas cromatográficas (troca iônica e par-iônico), permitem o preparo de amostra mais simples, reduz o efeito matriz e o viés referente a influência do analista no preparo de amostra, apresentando assim boa reprodutibilidade. Contudo essas técnicas apresentam um tempo elevado da corrida cromatográfica e consumo elevado do derivante quando comparado a técnica de derivatização pré-coluna (Okamoto et al., 1997; Nishimura et al., 2006; Nishibori et al., 2007).