Foram estudados 21 cabritos hígidos de trinta a sessenta dias de
idade (correspondente ao período pós-natal), com média de pesos igual a
8,35 kg (mínimo de 4,80 kg, máximo de 12,00 kg), tratados conforme as
normas para cuidado e uso de animais de laboratório 119.
Para atestar que os ventrículos cardíacos já haviam assumido o
padrão de pressão esperado para o período pós-natal, realizaram-se
exames ecocardiográficos basais antes de qualquer procedimento cirúrgico.
Os animais foram divididos, aleatoriamente, em três grupos: controle -
C (n= 7, sem nenhum procedimento cirúrgico), estimulação contínua - EC
(n= 7, metodologia explicada abaixo) e estimulação intermitente - EI (n= 7,
metodologia explicada abaixo). O número de cabritos por grupo foi
determinado segundo estudos anteriores desta linha de pesquisa 74,77,78.
3.1 Anestesia
Após jejum de 24 horas, os animais dos grupos de estimulação
contínua e intermitente receberam medicação pré-anestésica (quetamina, 30
mg/kg, intramuscular). Realizou-se tricotomia cervical e no hemitórax
esquerdo, seguida da punção na veia jugular externa com Jelco nº 18 para
administração de drogas. A anestesia foi mantida com pentobarbital sódico
(nembutal, 5-10 mg/kg, via intravenosa) e quetamina (1mg/kg endovenoso);
meio de tubo endotraqueal com 100% de saturação de oxigênio e volume
corrente de 10 a 15 ml/ kg. Por fim, os cabritos foram posicionados em
decúbito lateral direito e preparados para o procedimento cirúrgico estéril.
3.2 Dispositivo de bandagem ajustável do tronco pulmonar
O dispositivo utilizado neste estudo é formado por três componentes:
anel oclusor de silicone auto-selante, tubo extensor e botão de insuflação. O
anel oclusor (Braile Biomédica, São José do Rio Preto, SP) consiste em um
manguito hidráulico em forma de “U”, com diâmetro interno de 10 mm e
largura de 5 mm. Externamente, é revestido por silicone rígido com 1 mm de
espessura para evitar deformações centrífugas. A superfície interna é
formada por uma camada flexível de silicone, com capacidade de expandir-
se e comprimir, assim, o lume do vaso de acordo com o volume injetado
através do botão de insuflação. Nas duas extremidades distais do manguito,
existem pequenos orifícios que têm por finalidade manter o anel bem preso
ao tronco pulmonar. O tubo extensor, também feito de silicone, conecta o
anel oclusor ao botão de insuflação; possui 2 mm de diâmetro interno e 25
cm de comprimento. O botão de insuflação (Braile Biomédica) é um
reservatório circular feito de silicone auto-aderente, com base de metal;
possui um conduto conectado ao tubo extensor. Esse botão é implantado no
subcutâneo e permite a insuflação ou o esvaziamento do anel oclusor por via
Botão de insuflação auto-selante
Anel Oclusor
Figura 1 - Dispositivo de bandagem constituído por um anel oclusor ajustável,
tubo extensor e botão de insuflação.
3.3 Procedimento cirúrgico
Realizou-se toracotomia no quarto espaço intercostal esquerdo para a
exposição da aorta descendente e da via de saída do VD. Na aorta, fez-se
sutura em bolsa com polipropileno 5-0 para inserção do cateter de 16 gauge
(Bard Co) a fim de monitorar a pressão sistêmica. Dois outros cateteres de
16 gauge foram implantados, um no VD e outro distalmente ao tronco
pulmonar, fixados com polipropileno 5-0 por meio de sutura em bolsa. Os
cateteres foram testados (permeabilidade e curvas de pressão), mantidos
heparinizados e exteriorizados através da caixa torácica; as pressões foram
medidas pelo sistema de software ACQ Knowledge 3.01 (Biopac Systems,
Inc., Goleta, CA, EUA). Em seguida, o tronco pulmonar foi dissecado para a
colocação do dispositivo de bandagem ajustável. O anel oclusor foi colocado
ao redor do tronco pulmonar e suas extremidades foram suturadas com fio
pulmonar. O tubo extensor foi exteriorizado através do terceiro espaço
intercostal e conectado ao botão de insuflação alocado na camada
subcutânea da parede torácica. O botão de insuflação foi testado e todo o ar
do sistema foi retirado. As costelas foram aproximadas logo após a
colocação de um tubo de drenagem no espaço pleural esquerdo e as
camadas de tecidos moles foram fechadas, colocando-se, por fim, um colete
protetor. Os animais recuperaram-se da anestesia em maca especial
(Instituto do Coração – InCor – HC-FMUSP) para quadrúpedes, sofreram
extubação e tiveram o tubo de drenagem removido após um período de
quatro a seis horas do procedimento cirúrgico. Em seguida, foram
encaminhados para o biotério.
Como antibioticoterapia profilática, receberam 500 mg de cefalozina e
10 mg de gentamicina por via intramuscular a cada 12 horas, tendo início
imediatamente antes da cirurgia e terminando ao final do protocolo. Também
foram administradas digoxina (0,005 mg/Kg por via intravenosa a cada 12
horas) e heparina (2500 U a cada 12 horas, por via subcutânea).
3.4 Protocolo de insuflação do dispositivo de bandagem
ajustável
Os animais foram mantidos em descanso por um período de 48 horas
para recuperação. Em seguida, foi introduzido o protocolo de insuflação do
Com o animal consciente e imobilizado na maca especial, foram feitas
as leituras das pressões basais do VD, tronco pulmonar e aorta, com o
dispositivo totalmente vazio.
Após a leitura, deu-se início à insuflação progressiva do dispositivo
com água destilada a fim de que a pressão sistólica no VD alcançasse um
valor aproximadamente igual a 70% da pressão sistólica sistêmica
27,71-74,77,78
, desde que não houvesse queda superior a 10% nessa última.
Caso o cabrito apresentasse sinais clínicos de hipóxia importante (agitação,
dispnéia ou arritmias), o volume do dispositivo era reduzido a um valor
tolerável pelo animal. Os animais do grupo de estimulação contínua
permaneceram em treinamento por um período de 96 horas, com
insuflações progressivas a cada 24 horas, no limite máximo tolerado. No
grupo de estimulação intermitente, procedeu-se da mesma forma, porém
deixando o dispositivo inflado apenas por 12 horas ao dia: ao final desse
tempo, o mesmo era esvaziado completamente e assim mantido por mais 12
horas, até a próxima insuflação, perfazendo um total de 48 horas de
condicionamento.
O gradiente de pressão entre o VD e o tronco pulmonar foi calculado
através da subtração de suas pressões sistólicas.
A insuflação do dispositivo e a mensuração das pressões na aorta,
VD e tronco pulmonar foram realizadas diariamente, nos dois grupos. No
grupo de estimulação intermitente, as pressões também foram medidas com
o dispositivo desinflado. O volume de água aspirado do dispositivo era
modo geral, foi possível acrescentar um maior volume ao dispositivo a cada
dia de insuflação.
3.5 Estudo ecocardiográfico
Para a realização dos ecocardiogramas, os cabritos foram
tricotomizados no hemitórax direito, permanecendo acordados e em decúbito
esternal durante os exames. Utilizaram-se transdutores de 7,5 MHz para a
obtenção das imagens e de 2.5 MHz para a análise dos fluxos (Apogee CX,
ATL - Advanced Technologies Laboratories, Bothell, WA). Todos os animais
foram avaliados antes do procedimento cirúrgico com a finalidade de atestar
a espessura mais fina da parede livre do VD em relação ao VE (perda do
padrão circulatório fetal). No seguimento, os exames foram realizados
diariamente, após a insuflação do dispositivo de bandagem externa, em
ambos os grupos estimulados, durante os cinco dias de condicionamento.
No grupo de preparo intermitente, o último ecocardiograma foi feito com o
dispositivo vazio. Os cabritos do grupo controle foram estudados uma única
vez, por meio de um exame ecocardiográfico basal, antes de serem
sacrificados.
As espessuras do septo interventricular e da parede posterior do VE
foram mensuradas no modo M, no final da diástole, por meio do corte
paraesternal transverso na altura dos músculos papilares 120; no mesmo corte foram obtidos os índices de função sistólica do VE (porcentagem de
encurtamento da fibra miocárdica e fração de ejeção) pelo método do cubo,
conforme descrito 121.
A massa do VD foi calculada com base nas observações de Pontes et
al. 122 a partir da dissecção da parede livre dessa câmara, conforme proposto por Fulton et al. 123. O ventrículo assim isolado assume formato trapezoidal, cuja área é mensurada na fórmula:
A= b1 + b2 x h (cm2) onde A= área do VD 2
Transpondo a fórmula para o VD, b1, b2 e h corresponderiam aos
perímetros internos da parede livre dessa câmara, obtidos no corte
paraesternal transverso (na altura dos vasos da base e no nível dos
músculos papilares) e no corte apical quatro câmaras, respectivamente
(Figura2).
Figura 2 - Esquema das projeções ecocardiográficas para o cálculo da massa do
ventrículo direito (conforme Pontes et al.). VD- ventrículo direito; VE- ventrículo esquerdo; AD- átrio direito; AE- átrio esquerdo; VAo- valva aórtica.
Adaptado de: Pontes SC Jr, Assef JE, Barretto RB, Chaccur P, Moreira DA, Nina VJS, Nunes F, Melani RH, Correia EB, Dinkuisen J, Sousa AM. Estimation of right ventricular mass by two- dimensional echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 2005;18(5):427-34.
Devido à dificuldade para a obtenção desse último corte em cabritos
(pelo fato de terem o tórax com formato muito convexo), o mesmo foi
substituído pelo corte longitudinal quatro câmaras. Em cada uma das três
abordagens ecocardiográficas descritas, também foi mensurada a espessura
da parede livre dessa câmara, na região onde seus limites fossem mais
facilmente visibilizados; a seguir, obteve-se a média aritmética desses
valores. Uma vez calculada a área, a mesma foi multiplicada por 1, 055 (que
corresponde à densidade do miocárdio) e pela espessura média da parede,
calculando-se, assim, a massa ventricular direita segundo a fórmula:
M= A x 1,055 x e (g) onde M= massa do VD
e= espessura média da parede livre do VD
3.6 Exame morfológico dos corações
Após 96 horas de treinamento do ventrículo subpulmonar, os animais
dos grupos contínuo e intermitente foram sacrificados de acordo com as
normas para cuidado e uso de animais de laboratório 119. O mesmo procedimento foi realizado com os sete cabritos do grupo controle.
Como medicação pré-anestésica, foi administrada quetamina
(20 mg/kg, via intramuscular). Por meio de um cateter venoso percutâneo
colocado na veia jugular, administrou-se nembutal (15 mg/kg); a seguir, os
cabritos foram entubados e mantidos em ventilação mecânica. Através da
mesma incisão utilizada para o procedimento cirúrgico inicial, fez-se a
administrados, pelo cateter, heparina (500 U/kg) e cloreto de potássio até
que houvesse parada cardíaca.
3.6.1 ESTUDO HISTOLÓGICO E MORFOMÉTRICO
Todos os animais sacrificados tiveram seus corações fixados em
solução de formalina salina (formol a 10% em solução salina a 0,9%,
tamponado com fosfato de sódio monobásico e bibásico, para pH 7,0). Os
espécimes foram assim mantidos por um período de 24 horas. No
seguimento, após corte transversal ao nível da massa ventricular, obtiveram-
se secções de ambos os ventrículos e do septo interventricular (S). O lado
direito do septo foi tingido com tinta Nanquim para identificação imediata à
microscopia óptica.
As amostras foram processadas para análise histológica e, a partir
dos blocos, obtiveram-se cortes de cinco micrômetros (µm) de espessura,
utilizando-se micrótomo (Leica RM 2145). Os cortes foram pescados em
lâminas de vidro previamente tratadas com organosilano e levados à
temperatura de 37ºC para secagem e colagem. Seguiram-se as colorações
pelos métodos da hematoxilina-eosina (HE) e Picro-sirius vermelho, além
das reações de imuno-histoquímica descritas abaixo.
3.6.1.1 Diâmetro das fibras miocárdicas e dos núcleos
As medidas morfométricas foram realizadas por meio de um sistema
Leica Imaging Systems Ltd, 1997, Cambridge) 124. Uma câmara de vídeo (JVC modelo TK – 1280U) conectada a microscópio óptico (Leica DMLS)
transmite ao sistema cada campo microscópico que é, então, transformado
em uma imagem digital binária. Uma seqüência de operações matemáticas e
morfológicas permite identificar e quantificar todas as estruturas de
interesse.
Os cortes corados pela hematoxilina-eosina foram utilizados para
mensurar o diâmetro transversal das fibras miocárdicas e dos núcleos
(cortados longitudinal ou transversalmente). Para cada segmento do coração
(VD, VE e septo interventricular), foram medidos os diâmetros de sessenta
células e de seus respectivos núcleos, com aumento de 40X. As
mensurações foram realizadas na altura dos núcleos, em seu maior eixo
transverso; os campos foram analisados seqüencialmente; porém, as células
deveriam ter os limites bem definidos para que fossem avaliadas. Para o
septo interventricular, foram abordadas, separadamente, as metades direita
e esquerda do mesmo. Estimou-se o número de miocardiócitos a serem
medidos através do estudo da evolução da média de 20, 30, 40, 50, 60,
70,80 e 90 observações. Como, a partir de 60 células medidas, a variação
da média mantinha-se menor ou igual a 10%, estipulou-se então esse
3.6.1.2 Estudo da fração de área de colágeno
Estudaram-se cortes histológicos dos ventrículos direito e esquerdo
dos três grupos, corados pelo método de Picro-sirius vermelho. Esse método
cora o colágeno em vermelho e as fibras musculares em amarelo-pálido.
Utilizando o sistema computadorizado de análise de imagens 124, quantificou-se a fração de área de colágeno através da cor, por meio da
marcação prévia de uma região sabidamente preenchida por essa proteína,
de forma que o programa reconhecesse automaticamente todas as
estruturas coradas no mesmo tom (vermelho) como “colágeno”. Ajustes
manuais fortuitos foram necessários a fim de adicionar ou remover áreas
não marcadas ou reconhecidas incorretamente pelo sistema. Com lente
objetiva de 20X, analisaram-se vinte campos e o resultado foi expresso
como média da área ocupada por colágeno. Os campos foram escolhidos ao
acaso, evitando-se, entretanto, regiões ocupadas por vasos maiores que 50
micrômetros de diâmetro e áreas de grande retração do corte histológico.
3.6.1.3 Estudo imuno-histoquímico
Cortes histológicos de 5 µm de espessura foram submetidos a reações de imuno-histoquímica de acordo com o protocolo de rotina usado
na Seção de Imunopatologia do Laboratório de Anatomia Patológica do
Instituto do Coração (InCor) HC-FMUSP (sistema Streptavidina conjugada
com peroxidase) 125. Como controle positivo da reação, utilizou-se corte histológico de esôfago de um dos animais, obtendo-se células marcadas nas
porções basais do epitélio. Tal controle é feito com um segmento de órgão
em que as células apresentam alta capacidade de proliferação (como
epitélio, por exemplo), com a finalidade de comprovar se a prova imuno-
histoquímica aplicada é eficiente para o indivíduo estudado.
Lâminas contendo cortes de tecido foram desparafinadas em três
banhos de xilol, hidratadas e submetidas à técnica de recuperação de
antígenos com a finalidade de expor os epitopos teciduais para as reações
imuno-histoquímicas.
O marcador de proliferação celular utilizado foi o anticorpo primário Ki-
67, produzido em camundongo, clone MIB-1, código IM0505, fabricante
DAKO, Grostrup, Dinamarca. Conforme estabelecido em estudos anteriores,
esse marcador tem sido utilizado em tecidos de caprinos 126,127.
Para a recuperação antigênica, as lâminas foram imersas em citrato
de sódio (10mM) pH 6.0 e aquecidas em panela de pressão durante 15
segundos.
Depois de feita a recuperação de antígenos, as lâminas foram lavadas
em dois banhos de PBS (tampão salina fosfato 1M pH 7,4) e realizou-se o
bloqueio da peroxidase endógena pelo tratamento com peróxido de
hidrogênio 130 volumes a 3% em PBS. As lâminas foram então colocadas
numa câmara úmida e submetidas a soro fetal bovino por uma hora, em
estufa a 37 ºC. A seguir, foram secas e expostas ao anticorpo primário.
O anticorpo primário foi diluído em BSA (soro albumina bovina) 1%
Após a aplicação do anticorpo primário as lâminas foram deixadas
em câmara úmida a 4oC na geladeira, durante a noite. Após um período de 18 a 20 horas de incubação, foram então lavadas em três banhos de PBS
pH 7,4 e incubadas em câmara úmida com anticorpo secundário diluído em
PBS por uma hora, em estufa a 37ºC. Foi utilizado anticorpo secundário anti-
camundongo IgG biotinilado, produzido em coelho, código E0354 (DAKO),
na diluição de 1/200 em PBS, para marcação dos núcleos de miocardiócitos
e células do interstício e vasos em proliferação.
Houve, em seguida, passagem em três banhos de PBS e incubação
com estreptoavidina (Streptavidin/ HRP, código PO397, DAKO) conjugada
com peroxidase na diluição 1/100 em PBS por uma hora, em estufa a 37ºC.
As lâminas foram novamente lavadas em três banhos de PBS,
seguindo-se a revelação da reação, quando se usaram 3,0 tetracloridrato de
diaminobenzidina (DAB, código K3466, DAKO) – (0,04%), durante cinco
minutos em banho-maria, a 37ºC.
Após a passagem por água corrente, os cortes foram contracorados
com hematoxilina de Harris para evidenciar os núcleos. A seguir, foram
desidratados em banhos sucessivos de água corrente, álcool a 70%, álcool a
95%, álcool a 100%, xilol e cobertos com lamínula usando-se resina
sintética.
Os miocardiócitos e as células do interstício e dos vasos marcados
com o anticorpo (coloração castanho-dourada) foram quantificados
seu número/campo microscópico, utilizando-se objetiva de 40X. A área
correspondente a um campo de grande aumento analisado é de
232.428,13 µm2. Para o septo interventricular, calculou-se separadamente o número de células positivas nas metades direita e esquerda do mesmo. Para
cada corte histológico, calculou-se o número médio de células marcadas por
campo microscópico - miocardiócitos e células do interstício/vasos. Foram
analisados 60 campos para cada um dos segmentos cardíacos (VD, VE e as
duas metades do septo interventricular), visto que a variação da média
manteve-se menor ou igual a 10% a partir desse número de observações.
Considerando-se a possibilidade de hipertrofia celular e, portanto, de haver
menor número de células por campo microscópico, realizou-se também a
quantificação de células marcadas segundo a taxa de proliferação. Para
cada segmento do coração (VD, VE, SD- septo interventricular direito e SE-
septo interventricular esquerdo), foram contadas 4000 células (2000
miocardiócitos e 2000 células do interstício/vasos); das células contadas,
computou-se o número daquelas marcadas com o antígeno Ki-67, obtendo-
se a porcentagem de hiperplasia. Para o septo como um todo, foram
escolhidas aleatoriamente as primeiras 1000 células contadas em cada uma
das metades direita e esquerda. O número de células a ser contado foi
definido segundo dois critérios: quando a variação da média atingiu 10% e o
fato de trabalhos anteriores mostraram que 2000 células são uma
quantidade confiável para análise 92,103,128-131.
Por fim, para os VDs dos três grupos, comparou-se a proporção entre
3.7 Análise estatística
Inicialmente, todas as variáveis foram analisadas de modo descritivo.
Para as variáveis quantitativas, essa análise foi feita através da observação
dos valores mínimo e máximo, e do cálculo da média, erro padrão e
mediana.
Para a análise da hipótese de igualdade entre três grupos, utilizou-se
a Análise de Variância a um fator 132, com as comparações múltiplas através de Bonferroni.
Para averiguar o comportamento dos grupos, e considerando as
condições estudadas, fez-se uso da técnica Análise de Variância com
medidas repetidas 133, a qual consiste no ajuste de um modelo linear multivariado a partir do qual foram testadas as seguintes hipóteses:
H01: os perfis médios de resposta correspondentes aos grupos são
paralelos, ou seja, não existe interação entre o fator grupo (controle, EC e
EI) e o fator condição de avaliação (VE, VD, S, SE e SD).
H02: os perfis médios de resposta são coincidentes, ou seja, não
existe efeito do fator grupo.
H03: os perfis médios de resposta são paralelos ao eixo das
abscissas, ou seja, não há efeito do fator condição de avaliação.
As hipóteses H02 e H03 só foram testadas quando não se rejeitou H01.
Caso contrário, foram testadas hipóteses de igualdade entre subconjuntos
A estatística de Wilks, com a aproximação para a estatística F, foi
utilizada no teste das hipóteses acima.