Métodos de avaliação dos efeitos do contraceptivo

Para se estimar os efeitos do método contraceptivo aplicado, foram avaliados vários parâmetros que a seguir se analisam. De referir que, o tempo de estudo, foi de 3 meses, com início em Dezembro de 2012, com a colocação do implante e final, em Fevereiro de 2013 (Figura 3). A anestesia de re-avaliação e a união com a fêmea ocorreram posteriormente, e as interacções observadas para o casal em estudo ocorreram neste período e posterioremente. O macho permaneceu no mesmo cercado (cercado 9), de 5 a 13 de Dezembro de 2012, tendo acesso alternado a todo a sua área ou apenas a parte dela. No dia 13 de Dezembro de 2012 foi transferido para o cercado 8 e no dia 27 de Fevereiro de 2013 foi para o cercado 7, tendo igualmente, acesso ao corredor de intercomunicação (ci) do cercado 7 para o cercado 8 (Anexo III: Descrição dos cercados, Figura 10 e Figura 11).

A anestesia de re-avaliação ocorreu no dia 3 de Dezembro de 2013, a união do macho com a fêmea, no dia 9 de Maio de 2012, sendo que as interacções para o casal foram observadas desde dia 16 de Dezembro de 2012 até ao dia 31 de Maio de 2013 (Figura 3).

3.5.1 Ingestão de comida e apetite do sujeito em estudo

Para se avaliar a ocorrência de alterações na ingestão de comida provocadas pelo contraceptivo, foram analisados o apetite do sujeito e o volume ingerido de alimento. O animal foi alimentado pelos tratadores durante o maneio com o regime normal. A avaliação do apetite foi realizada pela equipa de tratadores segundo a escala: muito apetite - animal come de uma só vez, logo que o alimento lhe é disponibilizado, apetite médio - come em 24 horas todo o alimento disponibilizado e pouco apetite – não come todo o alimento disponibilizado em 24 horas, deixando restos.

Nota: É importante referir que, para controlo da epilepsia, o sujeito do estudo ingeriu uma vez por dia uma dose de 7,5 mg de Fenobarbital, que não sofreu qualquer alteração ao longo do estudo. O medicamento foi incorporado em parte do alimento, aproximadamente 50g de coelho morto, e foi-lhe oferecido diariamente pelos tratadores, mesmo nos dias de jejum.

43 3.5.2 Comportamento

Para avaliação do comportamento do animal foi utilizado o sistema de videovigilância. Diversas câmaras presentes nos cercados permitiram a monitorização não condicionada dos animais, 24 horas por dia, a partir da sala de coordenação.

Neste trabalho, o comportamento do macho foi avaliado recorrendo-se aos 3 tipos de métodos mencionados na revisão teórica (focal de observação contínua, de varrimento – Scan, pontual - oportunístico). Foram recolhidos pela aluna os dados das sessões de observação contínua do macho, do scan realizado diariamente por toda a equipa de etologia e ainda das fichas de interacção realizadas para o casal do estudo. A avaliação do comportamento foi realizada de Dezembro a Fevereiro, para não afectar o trabalho da equipa de etologia/videovigilância na época de partos, com início em Março. As interacções entre o sujeito e a fêmea escolhida, foram especialmente avaliadas, posteriormente, a este período com o mesmo intuito de, não afectar a normalidade dos trabalhos do CNRLI. No presente trabalho, tentou avaliar-se os padrões de actividade e inactividade do animal, a frequência das suas marcações e as suas interações com uma fêmea.

3.5.2.1 Sessões de observação contínua

Para se estudar o comportamento do animal em questão, utilizou-se um método de amostragem focal contínuo. As sessões de observação contínua foram efectuadas pela aluna e pela restante equipa de videovigilância, tendo-se determinado que as sessões teriam uma duração de duas horas. O início de cada sessão foi escolhida ao acaso, excluíndo-se as horas de maneio e de possível intervenção de tratadores e médicos veterinários nos cercados (das 08:00 às 12:00 e das 16:00 às 18:00) a fim de não afectar o trabalho do videovigilante nas suas tarefas diárias. No entanto, mesmo respeitando esses períodos, foram realizadas parcialmente 4 sessões e 17 não foram sequer realizadas por incapacidade do videovigilante monitorizar as suas tarefas em conjunto com as gravações das sessões. Não foram realizadas as sessões dos dias 6, 7, 8, 9, 10 e 11 de Dezembro, 2, 15 e 16 de Janeiro e 3, 13, 15, 20, 23, 26, 27 e 28 de Fevereiro.

As gravações foram realizadas recorrendo-se a uma câmara do cercado 9 (campeio) e a 4 câmaras do cercado 8 (maneio-campeio, parideira do maneio grande, superior e inferior do edifício parideira).

As gravações das sessões foram visualizadas posteriormente pela aluna, que registou todos os comportamentos revelados pelo animal naquele período, obtendo a ocorrência, duração e

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sequência de estados e eventos. Para registo dos comportamentos foi utilizado o etograma da espécie empregue diariamente na videovigilância do CNRLI com algumas modificações realizadas pela aluna, orientador e co-orientador e restante equipa de etologia (Anexo IV). O etograma original da espécie foi redigido em Castelhano e, portanto, para facilitar o trabalho e nomeadamente a utilização das siglas no preenchimento do etograma, a aluna utilizou as siglas originais que aparecem entre parêntesis nas definições do etograma. Quando foi necessário e para melhor compreensão das siglas, surge na definição do comportamento a palavra em Castelhano, em itálico. Todas as categorias de actividade foram contabilizadas para posterior análise de dados, nomeadamente o tempo fora de vista (fv), uma vez que neste período não se podia inferir se o animal estava ou não activo.

3.5.2.2 Scan

Para comparação do comportamento do sujeito em estudo com os restantes machos adultos do CNRLI (Calabacin, Drago, Éon, Enebro, Fado, Fauno, Foco e Fresco), utilizaram-se os dados recolhidos pela equipa de videovigilância através do scan diário. No scan diário tenta-se registar o comportamento de cada animal a cada hora, devendo o tempo, entre recolha de dados para um mesmo indivíduo, ser de aproximadamente 60 minutos. É realizado um varrimento completo do campeio na procura de cada animal que, quando localizado, deve ser observado por 10 segundos (este período aumenta se o animal estiver em movimento) para que o comportamento seja interpretado correctamente. Se o lince demonstrar mais do que um comportamento, o registado deve ser o que o animal apresentou logo no início da observação. O scan está estruturado em 12 categorias de informação (data, hora, minuto, observador, clima, lince, actividade, comportamento, localização, factor externo, elemento de enriquecimento ambiental e observações) que devem ser completadas a cada intervalo horário, para cada exemplar. Este método de amostragem e registo é uniforme para todos os centros de reprodução sendo muito importante seguir exaustivamente as instruções para manter a homogeneidade (Programa de Conservación Ex-situ del Lince Ibérico, 2013).

Com os dados recolhidos por este método, foi avaliada a frequência relativa das diversas categorias de actividade (actividade (a), inactividade (i), fora de vista (fv), sem câmara (sc), não identificado (ni), soma de fora de vista, sem câmara e não identificado (fv+sc+ni)) e a frequência absoluta de marcações realizadas para cada animal. Para a comparação dos valores do sujeito em estudo com os outros machos foi calculado para cada mês do estudo, um valor médio dos resultados obtidos para os restantes. Normalmente, na avaliação dos dados do scan no CNRLI, eles são excluídos quando a percentagem de fv (ou a soma da percentagem de

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fv+sc+ni) é superior a 30%. Porém, neste estudo, por decisão da aluna, orientador e equipa de etologia, excluíram-se apenas os casos em que aquele valor foi superior a 80%, para que o sujeito em estudo nunca fosse excluído.

3.5.2.3 Ficha de interacções

Para se avaliar o comportamento do sujeito em estudo perante uma fêmea e o seu comportamento sexual, o macho foi unido a uma fêmea (Janes) e as suas interacções foram registadas na ficha respectiva (Anexo V). O método de amostragem foi oportunístico baseando-se na detecção de interacções sempre que observadas pelo operador. Este registo, principalmente, antes e durante o cio, permite uma avaliação do comportamento social dos linces. No período anterior ao cio, inicia-se o processo de socialização dos pares que, inicialmente, consiste em manter o par em cercados contíguos, permitindo o acesso de um dos indivíduos ao passeio entre os cercados e depois permitindo o acesso de um animal ao campeio do outro, enquanto o último permanece fechado em maneios. Este processo é alternado, de forma a possibilitar a partilha de territórios e a troca de odores entre os animais, nomeadamente através da marcação. Todo o processo é seguido por câmaras, sendo as interacções registadas. No final de cada dia, realiza-se uma contagem das interacções positivas e negativas de forma a poderem ser avaliadas as possibilidades de união entre os exemplares. Depois dos pares estarem formados, o registo das interacções continua, a fim de se acompanhar a evolução do comportamento do casal desde a época de cio até às cópulas (Anexo IV).

A união do casal de estudo (Gamma e Janes) foi realizada fora da época reprodutiva, após 6 meses da colocação do implante. No entanto, o processo de socialização realizado foi semelhante ao referido anteriormente, tendo começado no dia 13 de Dezembro de 2012 e sendo permitida a primeira união no dia 9 de Maio. De referir que, para a observação desta união para além das câmaras já referidas, foi também utilizada a câmara de campeio do cercado 7.

3.5.3 Reprodução

A avaliação reprodutiva do sujeito foi realizada durante as anestesias já mencionadas. Foi realizado um exame físico geral, exame dos genitais externos, recolha e análise de sémen e ainda recolha de sangue, para posterior quantificação da testosterona sanguínea.

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3.5.3.1 Exame físico geral e exame dos genitais externos

O exame físico geral e o exame dos genitais externos foram realizados durante a anestesia para colocação do implante e novamente na anestesia de re-avaliação.

O exame físico incluiu a medição do peso do animal, recorrendo a uma balança analógica presente na clínica, e a avaliação da condição corporal, por observação directa do sujeito em estudo tendo em conta a escala de condição corporal do lince-ibérico (Anexo VI).

O exame dos genitais, consistiu na observação directa do pénis e testículos, na realização de medições testiculares, na avaliação da aparência das espículas penianas e sua medição, e ainda numa ecografia testicular para observação do parênquima (Figura 7 e Figura 8). A medição dos testículos foi realizada com a ajuda de uma craveira (comprimento e largura) e também, com o auxílio do ecógrafo (comprimento, altura e largura). Com os valores obtidos com este último calculou-se o volume de cada testículo e depois o total, ou o peso testicular, segundo o método descrito por Harcourt et al. (1995) (Gañán et al., 2009). Para cada testículo, volume=4/3 × π × (comprimento/2) × (largura/2) × (profundidade/2).O volume total ou peso testicular (g) = (testículo esquerdo (cm3) + testículo direito (cm3)) × 1,1, sendo o 1,1 o factor de conversão para calcular o peso de um tecido corporal a partir do seu volume (Gañán et al., 2009). A avaliação da aparência das espículas penianas foi realizada subjectivamente de 1 a 3, escala referida por Bertschinger et al. (2006): 1- pouco desenvolvidas, 2- moderadamente desenvolvidas, 3 – proeminentes. A medição quantitativa das espículas penianas foi realizada com o auxílio de uma escala de papel quadriculada com quadrículas de 1 cm de lado e linhas de 1 mm de largura.

Na anestesia de re-avaliação, a de Dezembro de 2013, para além do que já se referiu, foi também realizado um exame de sémen (recolha por electroejaculação) e colheita de sangue, para posterior quantificação da testosterona sanguínea do animal. De referir que nesta anestesia, os valores testiculares foram medidos antes da electroejaculação.

Figura 7 – Anestesia de 2012 - Realização de medições testiculares: (1) com craveira,

(2) com ecógrafo; (3) Avaliação da aparência das espículas penianas. (1) (2) (3)

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(Fotos originais)

Figura 8 – Anestesia de 2013 - Realização de medições testiculares: (1) com craveira,

(2) com ecógrafo; (3) Avaliação da aparência das espículas penianas.

(Fotos originais) 3.5.3.2 Exame do sémen

Metodologia da recolha de sémen

Dos métodos utilizados em animais selvagens para recolha de sémen (electroejaculação, estimulação manual, vagina artificial ou recolha pós-morte) a electroejaculação é o método mais utilizado visto necessitar de pouco treino e, o animal estar anestesiado, enquanto se realiza o procedimento (Spindler & Wildt, 2010). No presente trabalho, a recolha de sémen foi realizada por este método pela equipa do Doutor Eduardo Roldan (Madrid) seguindo o procedimento descrito por Gañán et al (2010) (Figura 9). Neste caso, foram realizadas apenas duas séries de estímulos.

Figura 9 – Electroejaculação: (1) material utilizado, (2) recolha de sémen

(Fotos originais)

Metodologia de análise do sémen

(1) (2) (3)

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A análise de sémen foi realizada pela equipa do Doutor Eduardo Roldan (Madrid) segundo o procedimento descrito por Gañán et al. (2010).

3.5.3.3 Avaliação do perfil hormonal

A análise hormonal é o método indirecto mais preciso para monitorizar o estado funcional do sistema reprodutivo, uma vez que as hormonas são os reguladores do sucesso deste sistema (Hodges, Brown & Heistermann, 2010; Spindler & Wildt, 2010). Estas estão presentes e podem ser medidas em várias matrizes biológicas, dependendo a escolha da matriz do tipo de informação pretendida, das técnicas de análise envolvidas, do metabolismo e via de excreção da hormona (diferente entre espécies) e da facilidade da sua recolha (Hodges et al., 2010). Os métodos não-invasivos de recolha de amostras são vantajosos no caso de animais em que o contacto deve ser evitado, como em jardins zoológicos e centros de reprodução. Porém, podem ser difíceis de recolher, sobretudo quando co-habitam com outros animais (Hodges et al., 2010).

A avaliação hormonal no decurso do estudo foi realizada unicamente por quantificação da testosterona sanguínea, aquando da anestesia de re-avaliação.

Testosterona no sangue

1. Metodologia da recolha de sangue, armazenamento e envio

O sangue para quantificação da testosterona, foi recolhido por punção da veia safena esquerda do animal (butterfly de 21 Gauge). A amostra pretendida foi recolhida para um tubo com gel para separação de soro e, em seguida, foi imediatamente refrigerada (4 a 8ºC). Após, 20 minutos, aproximadamente, a amostra foi centrifugada (15 minutos, 3000 rpm a 21ºC), tendo- se colocado, 1mL do soro obtido, num tubo eppendorf. A amostra foi então congelada a - 20ºC. Para expedição, ainda congelada, foi colocada no interior de uma caixa de esferovite (própria para envio de amostras) com placas termoacumuladoras no seu interior e foi enviada para a IZW (Berlim).

2. Metodologia de medição da testosterona no sangue:

A medição da testosterone sanguínea foi realizada pela equipa da IZW (Berlim) segundo o procedimento referido por Gӧritz et al. (2009b).

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